[发明专利]头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法

权利要求书

1.头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析的方法，其包括以下步骤：

(1)材料提供：提供超高效液相色谱系统和液相色谱-质谱联用仪，提供头花蓼药材，提供抑菌检测用菌株；

(2)药物提取与分离：

(21)取头花蓼药材加6~8倍量60~80%乙醇提取2次，每次1~2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花蓼醇提浸膏；所述60~80%乙醇中添加了0.05%硫代甘油和0.002%冰乙酸；

(22)另取头花蓼醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用20~40%甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离；

(23)分别用体积分数为30%、35%~40%、40%、40%~50%、50%、60%、60%~80%的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A~G共七个不同极性的部位；

(24)精确称取A~G七个部位，分别溶于DMSO中，配成质量浓度为25mg/mL的溶液，备用；

(3)UPLC分析与质谱分析：

(31)色谱及质谱条件：

色谱条件：C₁₈色谱柱，柱温40 ℃，流速0.35 L/min，进样量2 μL，流动相使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为0.1%甲酸水溶液、流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；

所述梯度洗脱的洗脱程序为：0~0.5min，95%流动相A；0.5~20min，95%流动相A→81.5%流动相A；20~30min，81.5%流动相A→95%流动相A；30~32min，95%流动相A；

质谱条件：电喷雾离子源，干燥气体温度180 ℃，毛细管电压4 500 eV，负离子检测模式，喷雾压力0.25 MPa，干燥气氮气流速8 L/min，扫描范围m/z 100~2 000，碰撞能量10eV；

(32)不同极性部位指纹图谱建立：按“(31)色谱及质谱条件”项下条件建立不同极性部位的UHPLC-TOF-MS色谱图，并通过质谱确定不同极性部位各峰对应的化合物，从而确定各个部位中的主要化学组成；

(4)最低抑菌浓度的测定：

(41)按最低抑菌浓度测定方法，进行菌悬液的配制和实验用琼脂平板培养基的制备；

(42)按最低抑菌浓度测定方法，测定步骤(24)所得不同极性部位的最低抑菌浓度；

(5)头花蓼不同极性部位各峰与1/MIC之间的偏最小二乘回归分析：对于每一个部位，使用SPSS16.0软件的偏最小二乘回归分析法通过其均值化进行分析，以其各物质峰的峰面积作为自变量，1/MIC作为因变量，分析得到各物质峰与药效指标之间的关系，确定与试验菌株成正相关的物质峰以及这些物质所存在的部位。

2.根据权利要求1的方法，所述超高效液相色谱系统是1290 Infinity型超效高液相色谱系统。

3.根据权利要求1的方法，所述液相色谱-质谱联用仪是Agilent公司的TOF LC/MS联用仪。

4.根据权利要求1的方法，所述头花蓼药材是采自贵州的头花蓼。

5.根据权利要求1的方法，所述抑菌检测用菌株包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(21)中，取头花蓼药材加7倍量70%乙醇提取2次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，并回收乙醇并浓缩至60 ℃下的相对密度为1.20~1.25的稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花蓼70%醇提浸膏；提取所用乙醇中添加了0.05%硫代甘油和0.002%冰乙酸。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(22)中，取头花蓼70%醇提浸膏样品45g，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，3000 rpm离心5 min，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用30%甲醇溶解载入MCI型大孔树脂柱层析分离。