[发明专利]检测PML基因突变的方法、引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与急性早幼粒白血病(APL)发生有关的PML基因突变的引物、方法和试剂盒。

背景技术

急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一种起病凶险的恶性血液病，单纯依赖化疗，患者复发率高，总体生存较差。APL在中国人群中的发病率较其他人群高，可高达AML的17％～25.3％。APL的分子遗传学标志是PML-RARA融合基因的形成，产生的PML-RARA融合蛋白不仅是APL的分子标志，而且在APL发病中起关键作用。PML-RARA融合蛋白可以与维甲酸受体(RXR)结合，中断正常的维甲酸信号通路，抑制基因转录，阻滞粒细胞分化，最终导致APL的发生。近来研究表明PML-RARA的降解在APL白血病干细胞(leukemia-initiating cell,LIC)的清除中起着重要的作用。

PML基因位于15号染色体，包含10个外显子，属于TRIM家族。PML选择性剪接产生了不同分子量的亚型：PMLI是最长的亚型，由882个氨基酸组成，最短的亚型是PMLVIIb，仅有435个氨基酸构成。RBCC/TRIM结构域存在于所有的PML亚型中，由外显子1～3编码。RBCC结构域有一个末端环指结构域(R)、两个B-box结构域(B1和B2)和一个α螺旋卷曲螺旋结构域组成。PML蛋白具有多种生物学活性，包括抗病毒活性、肿瘤抑制作用、参与祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等等。有研究表明PML的降解对于慢性粒细胞白血病(CML)静止期LIC的清除有重要作用。PML的类泛素化促进前髓细胞白血病核小体(PML-NBs)形成，从而促进PML依赖的肿瘤抑制效应。

三氧化二砷(As₂0₃)治疗可以使APL患者达到完全缓解，能够选择性地作用于PML-RARA和PML，导致蛋白降解。As₂0₃能够促进PML的核基质转移、SUMO化修饰和降解，在6h左右能够促进PML-NBs的增大；对于APL细胞，As₂0₃在12h左右能够促使PML-NBs重新形成，24h左右能够促使PML-RARA的降解。有研究显示As₂0₃对PML-RARA有类似的生物学效应，而对RARA则没有作用，这也说明PML-RARA融合蛋白中的PML部分是As₂0₃的直接作用靶点。

2014年最新版美国权威指南NCCN(National Comprehensive Cancer Network)和我国急性早幼粒细胞白血病诊治指南均新增维甲酸+砷剂作为APL患者的一线选择推荐。黄晓军课题组在一项研究中首次发现4个新的PML突变位点——A216T/S214L/L217F/S220G，并提出砷剂耐药时PML突变存在一个“突变热点区(C202-S220)”，该热点突变区位于PML基因的外显子3，即RBCC结构域中的B2结构域。文献报道指出，A216V、S214L、A216T对砷剂治疗具有强耐受，L217F、S220G对砷剂治疗表现弱耐受。这些发现完善了人们对APL患者砷剂耐药机制的认识。

因此，对PML基因多态性的检测，将有助于APL患者在砷剂治疗过程中进行耐药监测，从而及时调整治疗方案，提高治愈率，减少复发，在临床上具有重要的意义，有望实现APL的分层治疗和个性化治疗，并为下一步克服耐药的研究提供靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供检测PML基因突变的引物，所述引物包括：至少一对扩增引物用于扩增PML基因，所述至少一对扩增引物选自

PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、

PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、

PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、

PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、

PML-Exon10-F/PML-Exon10-R，其碱基序列为：

PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG

PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC