[发明专利]一种临床用脐血单核细胞的制备方法

权利要求书

1.一种脐带血单核细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1：脐带血初步筛选与保存：将分离、经过初步筛选的脐带血置于4～7℃下保存；

步骤2：培育：将脐带血样本置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，2～8％CO2的细胞培养箱中孵育2h；

步骤3：吸取：待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBS缓冲液轻洗涤2次，加入少量RPMI-1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞；

步骤4：收集：将步骤3中收集到的贴壁细胞离心，去上清液，得单核细胞；

步骤5：细胞培养：取步骤4中收集到的单核细胞到培养基进行培养，调整细胞密度至1.1×10⁸/T75瓶；

步骤6：单核细胞冻存和检测：收集细胞并计数和活率，按4×10⁷/ml/管进行冷冻保存；并将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取3×10⁶细胞做细胞表面标志检测；

步骤7：单核细胞的使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述脐带血是从健康足月产妇志愿者中采集、筛选而来；

初步筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中的CO₂的分数也可以是4～8％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中离心的条件是800～1500r/min,3～10min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中离心的条件是1000r/min,5min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6中，使用的冷冻保护液为体积分数为6％血浆的DMSO溶液。

7.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，所述方法还包括根据实际需要对红细胞进行裂解的步骤。

8.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，所述方法还包括合并、收集单核细胞的步骤。

9.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，所述方法还包括所述单核细胞冻存之后对单核细胞进行复苏的步骤。

10.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤6所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。