[发明专利]一种检测结核分枝杆菌的试剂盒

说明书

本发明公开了结核分枝杆菌的基于LAMP技术的检测试剂盒。LAMP引物根据结核分枝杆菌的特异保守序列设计，每组引物包含4条寡核苷酸。用于结核分枝杆菌检测时，肉眼观察呈白色沉淀；阳性反应加入SYBR Green后，在紫外灯下观察荧光绿色显著增强。实时浊度仪检测结果显示产物浊度随反应时间延长而增加，经凝胶电泳检测后呈梯型条带。本发明为结核分枝杆菌检测提供了一个新的技术平台，适宜在基层单位、现场监测和床旁检测中推广应用。

技术领域

本发明属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在结核分枝杆菌检测方面的应用，即结核分枝杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。该病全球流行，为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。

细菌培养和涂片检查是应用最为广泛的病原学诊断技术之一，其中痰液培养约占50%以上。痰液标本检验对于呼吸道疾病的诊断和鉴别具有重要的临床意义。但，传统习惯程序的痰液标本细菌学检验其临床符合率并不高。除了痰标本采集不规范导致的不合格标本带来的培养结果与病人感染不相符外，还因为微生物和人体的相关性本身就具有复杂性：源自细菌的致病与条件致病的辨证性，如致病菌可能为正常携带，而细菌在肺通气功能异常病人的下呼吸道的可以发生单纯定植或感染，要证明培养结果与感染的相关性是医学微生物学所面临的难题，这也使得一直以来在对于痰培养的标准化进展十分缓慢。

国内外对结核分枝杆菌的检测试剂主要基于抗体检测、核酸检测和药敏培养基检测等。目前，核酸检测已成为结核分枝杆菌检测的主要方法：PCR-荧光探针法、环介导恒温扩增法、荧光PCR熔解曲线法、PCR-反向点杂交法、DNA微阵列芯片法等。其中，环介导等温扩增法具有检测灵敏度高、结果判断直观，且不需要荧光定量PCR仪等价格昂贵的设备等优点，具有广泛应用前景。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型等温核酸扩增技术，具有快速、简便、经济、灵敏等优点，目前已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计2对引物(FIP[F1c+F2]、BIP[B2+B1c]、F3、B3)，在链置换型DNA聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内(30~90min)进行核酸扩增。在反应过程中，当一个dNTP分子结合到DNA链上时会解离下一个焦磷酸根离子，后者与镁离子结合形成大量副产物——焦磷酸镁，反应结果无需电泳检测，肉眼可见白色沉淀，加入荧光染料后可观察到绿色荧光。与传统PCR相比，LAMP具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判定简单、成本低廉等特点。LAMP检测灵敏度至少比普通PCR 高出2个数量级。此外，等温扩增仅需一个水浴锅或恒温装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。LAMP反应结果的检测不需要像普通PCR进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光即可，是一种高效、简便、快捷、高通量的检测方法。

本发明开发了一种针对结核分枝杆菌的环介导等温扩增试剂盒，可对痰液样本中的结核分枝杆菌进行高效、简便、有效的检测。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种用于结核分枝杆菌核酸检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

1. 结核分枝杆菌的LAMP检测专用引物

根据结核分枝杆菌基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件Primer ExplorerV5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。