[发明专利]一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法

权利要求书

1.一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：

步骤S1：制备透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系；

步骤S2：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到上述发光体系内，进行酶切反应，反应后所得的各混合溶液分别进行离心超滤，收集各超滤液，将各超滤液分别与PBS缓冲液混合均匀，或者将各超滤液分别与正三丙胺和PBS缓冲液混合均匀，得到不同的混合体系，使用BPCL微弱化学发光测量仪测量各混合体系的电化学发光信号；

步骤S3：根据收集的各混合体系的电化学发光信号，绘制标准曲线；

步骤S4：将待测样品加入根据步骤S1制备的发光体系内，反应后所得的混合溶液进行离心超滤，收集待测超滤液，将待测超滤液与正三丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到待测体系，使用BPCL微弱化学发光测量仪测量该待测体系的电化学发光信号，将该电化学发光信号结合标准曲线，得出待测样品中透明质酸酶浓度。

2.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述步骤S1具体如下：

步骤S1-1：将1.4 mg/mL的透明质酸溶液与4 mg/mL的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液按照体积比495∶5混合均匀，室温反应40-50分钟，得到体积为V的混合液；

步骤S1-2：将上述混合液置于超滤管中，离心，收集浓缩液；

步骤S1-3：将上述浓缩液用浓度为10 mM的 PBS缓冲液进行离心洗涤，重复2-3次，将最终得到的浓缩液用浓度为10 mM、pH为7.4的 PBS缓冲液稀释至体积为0.6V，得到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系。

3.根据权利要求2所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：步骤S1-2的离心转速为13000-15000rpm，离心时间为 25-35分钟。

4.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述步骤S2具体如下：

步骤S2-1：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系中，在37 ℃下进行酶切反应110-130分钟，得到第一溶液；

步骤S2-2：将第一溶液置于超滤管中，离心，收集超滤液；

步骤S2-3：将超滤液与PBS缓冲液混合均匀，或者将超滤液与正三丙胺溶液以及PBS缓冲液混合均匀，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测量其电化学发光信号。

5.根据权利要求4所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述透明质酸酶、透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液、正三丙胺溶液、PBS缓冲液的用量比为100µL∶300µL∶8µL∶2 mL。

6.根据权利要求4所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.4。

7.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述步骤S4具体如下：

步骤S4-1：将待测样品加入到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系中，在37 ℃下反应110-130分钟，得到第一溶液；

步骤S4-2：将第一溶液置于超滤管中，离心，收集超滤液；

步骤S4-3：将超滤液与正三丙胺溶液、PBS缓冲液混合均匀得到待测体系，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测量该待测体系的电化学发光信号，将该电化学发光信号结合标准曲线，得出待测样品中透明质酸酶浓度。

8.根据权利要求7所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述待测样品、透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液、正三丙胺溶液、PBS缓冲液的用量比为100µL∶300µL∶8µL∶2 mL。

9.根据权利要求7所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.4。