[发明专利]一种细胞分散剂

说明书

本发明提供了一种细胞分散剂，含有EDTA、胶原酶和胰蛋白酶。使用该细胞分散剂细胞分离效果好，且成本低。具体的，EDTA浓度为0.02％、胶原酶浓度为0.1％和胰蛋白酶浓度为0.2％。

技术领域

本发明涉及一种细胞分散剂，具有的含有EDTA、胰蛋白酶和胶原酶。

背景技术

细胞分离常用的方法分为悬浮细胞的分离方法和实体组织材料的细胞分离方法。

悬浮细胞的分离方法，组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心机离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养；若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

(1)机械分散法

若组织纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

(2)消化分离法

组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：

胰蛋白酶分散技术是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

由于胰蛋白酶的活力和纯度等因素对细胞分散的影响较大，而胶原酶分离效果好，但价格高，增加成本。迫切需要一种成本低，分离效果好的细胞分散剂。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种细胞分散试剂，该试剂分离细胞效果好，且成本低。进一步，本发明还提供一种细胞分散方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种细胞分散剂，含有离子螯合剂、胶原酶和胰蛋白酶。EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)，是一种螯合剂(chelatingagent)，能与组织内的Ca2+、Mg2+离子螯合而使细胞分离。EDTA作用温和，在一般情况下对细胞损伤较小，但分离效果并不很高。