[发明专利]长效重组人促红素的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种长效重组人促红素的生产方法。

背景技术

促红素(Erythropoietin，EPO)是一种促进红系造血前体细胞分化、繁殖的细胞因子，是一种糖蛋白激素，分子量约34KD，产生于人的肾及胎儿的肝脏中，早期主要从尿中提取。重组人促红素(rhEPO)是利用基因工程技术，将人的促红素基因转入哺乳动物细胞内，高效表达的能刺激红细胞生产的糖蛋白激素，用于治疗慢性肾功能衰竭和贫血。但是，rhEPO的平均体内半衰期较短，造成患者给药频繁，这对患者和医护人员都产生了负担。因此，开发长效rhEPO就显得很有必要。

在延长rhEPO半衰期方面，目前的尝试包括增加EPO分子的糖含量；以及通过化学缀合聚乙二醇等来增加EPO蛋白的分子量，但PEG化可能导致EPO部分的功能和特异性不可预期的改变。而将EPO与人免疫球蛋白(IgG)的Fc片段相结合，具有独特的优点。IgG是人血液中最丰富的蛋白之一，半衰期可达21天。人免疫球蛋白IgG由4个通过二硫键共价连接的多肽组成。通过木瓜蛋白酶来水解IgG分子产生两个Fab片段和一个Fc片段，Fc片段由通过二硫键连接在一起的两个多肽组成。Fc片段包含CH2和CH3结构和铰链区，EPO肽部分直接连接至铰链区，构成rhEPO-Fc融合蛋白。试验证明，rhEPO-Fc融合蛋白的二聚体不仅稳定性好，而且活性更高。

在工业化生产中，在分离纯化rhEPO-Fc融合蛋白时，一般采用两步或三步纯化。但是，在纯化过程中，目的蛋白的损失是不可避免的，一般来说纯化步骤越多，纯化后产品纯度越高，目的蛋白得率越低。例如，“rhEPO-Fc融合蛋白的表达、纯化及质量研究”(杨建军等，《中国生物工程杂志》，2007，27(6))采用0.45微米滤膜过滤，用Protein A柱分离，再用Q-Sepharose离子交换柱分离，随后用Sephacryal 200凝胶层析柱纯化，纯度达到98％以上，但得率只有45％以上，其中Protein A步骤得率85.1％，Q-Sepharose得率83.3％，Sephacryal 200得率65.1％。CN105884906A先用MabSelect SuRe亲和层析进行纯化，再用Capto adhere复合型阴离子交换层析，纯度达到98.5％，得率70％。但是，MabSelect SuRe规格200ml价格20000元，Capto adhere规格100ml的价格在10000元以上，其成本对于工业化来说也是较大的负担。因此，在保证同等产品纯度下，如何降低生产成本，是工业化生产企业不得不考虑的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种长效重组人促红素的生产方法，这种方法能够保证rhEPO-Fc融合蛋白产品纯度达到98％，rhEPO-Fc融合蛋白得率高，而且纯属化需要的材料成本较低。

本发明采用如下技术方案，其生产步骤包括：

(1)将人IgG2的Fc片段基因连接到人促红素基因的3′端，利用脂质体将含有hEPO-Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；CHO细胞用无血清基质经扩增培养，在培养液中分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白；

(2)培养液经过离心，取上清液，调pH值至3.5-4.0，上清液变浊，离心或过滤除去沉淀物；

(3)除去沉淀物后含目的蛋白的溶液上rProtein A Beads层析柱进行层析分离，得粗rhEPO-Fc融合蛋白；

(4)粗rhEPO-Fc融合蛋白用分子筛Superdex 200 prep grade进行纯化，得精rhEPO-Fc融合蛋白。

进一步的，所述步骤(2)中调节pH值的采用盐酸溶液，以尽量减少离子种类，与常用的酸酸和柠檬酸相比，更有利于后续除盐。

进一步地，所述步骤(3)为：将步骤(2)过滤后的滤液，用NaOH调节pH值到中性，上rProtein A Beads层析柱，柱规格5cm*8cm，然后用5倍柱体积的pH7.0的缓冲液进行洗杂，所用缓冲液为0.15MNaCl-20mMNa₂HPO₄，然后用10倍柱体积的pH3.0的0.1M甘氨酸洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，用NaOH调节pH值到中性。采用5倍体积缓冲液洗杂，可以减少目的蛋白损失。

进一步地，所述步骤(4)上分子筛纯化过程为：分子筛Superdex 200 prep grade层析柱先用pH7.0的150mMNaCl缓冲液平衡，再将样品上柱纯化。