[发明专利]一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法

权利要求书

1.一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法，其特征在于：通过将菌根真菌印度梨形孢接种于无菌的兰科根部，通过保存培养基，实现常温下长期保存的目的;

具体方法包括如下：

（1）印度梨形孢菌保存培养基制备

每升保存培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15g/L、甘露糖15-20g/L、琼脂粉5-6g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，以覆有0.5 cm透气孔的透气膜或透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用；

（2）无菌兰科植物制备

在无菌环境下，将无菌的带有根部的兰科植物茎段或小苗接种于所述保存培养基，置于20-28℃，2000 lx、14 h/d光照条件，培养7-10 d备用；

（3）接种与保存

在无菌条件下打开步骤（2）所述兰科植物培养瓶，用打孔器把于PDA培养基新培养一周的印度梨形孢菌菌环周围具活力的菌块接种至兰科植物根部，菌块距离兰科植物根部0.5-1 cm处，接种后置于28℃、黑暗条件培养4～5天，转入20-28℃，2000 lx、14 h/d光照条件，培养保存；

（4）恢复培养基制备

每升恢复培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15 g/L、香蕉泥50-100 g/L、琼脂粉5-6 g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，以覆有0.5 cm透气孔透气膜或透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用；

（5）恢复培养

将明显具有根毛变多共生特征的植物茎段、植株或根部接种于所述恢复培养基，转入20-28 ℃，2000 lx、14 h/d光照条件，培养保存；培养1周可见从菌根部长出幅射状白色菌块；

（6）检测

利用印度梨形孢菌特异性引物PiEF-F: CGCAGAATACAAGGAGGCC和PiEF-R:CGTATCGTAGCTCGCCTGC，对菌块DNA进行PCR扩增，25μL PCR 反应体系：10×PCR buffer (plus Mg ²⁺) 2.5 μL，2.5 mmol∙L^-1dNTPs 0.5 μL，10 μmol∙L^-1正向引物1 μL，10 μmol∙L^-1反向引物1 μL，5 U ∙μL^-1Taq0.2 μ L，ddH₂O 18.8 μL；PCR反应程序：94 ℃预变性4 min，94℃变性45 s, 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，设35个循环，最后72 ℃延伸10 min；1.0%(W/V)琼脂糖电泳检测 PCR产物，可见290bp附近有阳性条带，则表明所保存并分离的为印度梨形孢菌。