[发明专利]快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种HRM检测引物、试剂盒及方法，具体地说，是一种鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物、试剂盒及方法；属于生物检测技术领域。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2016年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。其中，PCV1被认为是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性[5]。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)主要病原，与猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎(PNP)和肠炎等疾病密切相关，均为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。

临床上，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪肺炎支原体(M.hyo)等病原体混合/继发感染，造成养猪业巨大经济损失。

2003年全球范围内PCV2发生由PCV2a向PCV2b基因型转变，病毒致病力增强，对养猪业危害加重。2012年PCV2在世界范围内再次发生基因型转变，由PCV2b向致病力更强PCV2d转变，现有疫苗免疫效果降低。2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情，与历史平均值相比，该猪场母猪死亡率升高10.2％、受孕率下降0.6％。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。Palinski等借助新一代测序(NGS)技术，从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于70％，根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为PCV3。

目前，市场上并没有专门针对猪圆环病毒不同型的检测试剂盒。

我国已出现PCV3感染病例，主要集中于中东部地区。全国范围内急需开展PCV3流行病学调查，“早发现、早报告、早隔离、早诊断、早扑灭”，及时控制和扑灭疫情

鉴于PCV3具有传播途径多、传播速度快、流行范围广等特点，应尽快研发适用于出入境口岸PCV3快速筛查与准确鉴定需求的检疫技术和产品迫在眉睫。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物。

本发明的第二个目的在于提供一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测试剂盒。

本发明的第三的在于提供一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型HRM检测方法。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物，其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1：5’-GTTGCVGAGMAGHTCCCTG-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物P2：5’-CCATTGTAACCATCCCACCA-3’(SEQ ID NO：2)。

本发明提供的第二个技术方案是一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测试剂盒，该试剂盒含有的引物为：

上游引物P1：5’-GTTGCVGAGMAGHTCCCTG-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物P2：5’-CCATTGTAACCATCCCACCA-3’(SEQ ID NO：2)。

本发明提供的第三个技术方案是一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测方法，该方法包括以下步骤：

1)从样品中提取病毒核酸；

2)以核酸为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的以及荧光饱和染料，进行PCR扩增反应获得扩增产物；

3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

优选的，上述的方法步骤2)中PCR扩增的反应体系为：

优选的，上述的方法步骤2)中PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min。

优选的，上述的方法步骤3)HRM分析过程中，80℃到95℃以每0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。