[发明专利]一种源于光敏色素的黄色荧光标记物的制备方法

说明书

本发明公开了一种源于光敏色素的黄色荧光标记物的制备方法，融合蛋白包括蓝细菌光敏色素蛋白slr1393的第3个GAF结构域和链霉亲和素。本发明的融合蛋白序列，易于在微生物中稳定表达，规避了高纯度天然藻胆蛋白和蓝细菌光敏色素的获取困难，制备成本较高；化学修饰剂的使用；天然藻胆蛋白聚合形态不稳定等缺点。本发明的表达方法，无需藻胆蛋白裂合酶参与，减少转化的基因数量，提高菌种稳定性和筛选效率。同时通过优化发酵培养基和发酵条件，大大提高了融合蛋白的产量。

技术领域

本发明涉及融合蛋白表达领域，特别涉及一种光敏色素荧光标记物的制备方法。

背景技术

荧光探针(或荧光标记物)是荧光免疫检测技术的重要基础原料，主要是通过化学修饰法，将荧光底物同生物素-链霉亲和素系统结合得到，可进一步放大荧光信号，提高免疫检测的灵敏度。

天然藻胆蛋白是最常见的荧光底物之一，其天然结构一般为六聚体，亚基由脱辅基蛋白和藻胆色素，通过裂合酶催化结合而成。藻胆色素则由血红素经过血红素氧化酶(HO1)和各种胆绿素还原酶催化形成，常见的藻胆色素有藻红胆素(PEB)，藻尿胆素(PUB)，藻蓝胆素(PCB)和藻紫胆素(PVB)。通过结合不同的藻胆色素，藻胆蛋白吸收400nm～700nm范围内不同波段的光后，可发出不同的荧光。

传统的藻胆蛋白荧光探针制备流程，首先是获取高纯度天然藻胆蛋白，然后通过化学修饰法，与生物素-链霉亲和素系统结合，进一步纯化后再用于免疫检测。但是高纯度的天然藻胆蛋白获取困难，制备成本高，同时结构不稳定，聚合形态多变。这使得藻胆蛋白荧光探针的成本居高不下。

通过微生物表达融合蛋白是一种成本较低的蛋白制备方法。然而融合蛋白的表达往往受到融合基因的设计和发酵工艺的限制，并不能稳定的表达，难以得到质量稳定的合格产品。

如何选择合适的蛋白片断进行融合，使其可以更为稳定地发酵生产，是有待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种易于表达的融合蛋白序列及其表达方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种融合蛋白，其包括蓝细菌光敏色素蛋白slr1393的第3个GAF结构域和链霉亲和素。

作为上述融合蛋白的进一步改进，融合蛋白中还添加有亲和标记。

作为上述融合蛋白的进一步改进，融合蛋白的序列为：MGSSHHHHHHSQDPEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGLQNIFRATSDEVRHLLSCDRVLVYRFNPDWSGEFIHESVAQMWEPLKDLQNNFPLWQDTYLQENEGGRYRNHESLAVGDVETAGFTDCHLDNLRRFEIRAFLTVPVFVGEQLWGLLGAYQNGAPRHWQAREIHLLHQIANQLGVAVYQAQLLARFQE。

表达上述融合蛋白的核苷酸序列。进一步的，核苷酸序列根据宿主菌进行密码子优化。

插入有上述核苷酸序列的质粒。

作为上述质粒的进一步改进，质粒为pET Duet载体质粒，核苷酸序列通过酶切位点BamHⅠ、EcoRⅠ插入pET Duet载体质粒的多克隆位点1。

一种融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)根据上融合蛋白的序列，设计得到融合蛋白基因序列；

2)将融合蛋白基因序列插入到质粒中，得到融合蛋白质粒；