[发明专利]一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法及其采用的前处理固相材料

说明书

本发明公开了一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法及其采用的前处理固相材料。该方法先以溶剂提取内源性油菜素甾醇，用吸附有硼亲和试剂的固相材料对所得提取溶液中的油菜素甾醇进行衍生和同步萃取，然后在解吸时同步引入盐诱导相转移萃取，进一步除去过量硼亲和试剂及亲水性杂质，进而实现了植物样品中内源性油菜素甾醇的选择性富集。该方法简单、快速、高灵敏、高通量，尤其在去除植物提取液内源性杂质方面表现出高选择性，可实现低含量的内源性油菜素甾醇的前处理，结合化学衍生，进而提高分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种植物样品中内源性油菜素甾醇选择性富集的样品前处理方法及其前处理固相材料，属于分析化学领域。

背景技术

油菜素甾醇(brassinosteroids,BRs)是一类多羟基化的甾醇类化合物，在植物体内含量极低，但调控着植物的一系列生理学和代谢过程。近年来，关于油菜素甾醇的生理学机能，例如BRs的生物合成，降解以及代谢路径的研究收到广泛关注。但由于植物提取液中基质复杂且油菜素甾醇含量极低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合灵敏的检测手段是内源性BRs检测的关键。

目前，基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)的方法因其高灵敏度和高选择性已成为BR分析方法的主流，然而仍存在问题：

一是，植物基质复杂，干扰BR的检测。基于此，人们引入了多种前处理方法对BR进行萃取除杂。已报道的植物中油菜素甾醇的前处理方法包括液液萃取、固相萃取(SPE)、固相微萃取、磁固相萃取和固相分散微萃取等。这些方法大都利用材料与BR之间的疏水或亲水相互作用，选择性不佳。随后人们提出的利用硼亲和材料中的硼酸基团与BR顺式羟基间的硼亲和作用实现对BR的萃取。尽管选择性得到较大改善，但材料合成复杂繁琐，BR与材料间的解吸困难，往往需要引入双氧水等氧化剂。例如，CN2013101314228中对BR进行萃取时，需采用提前合成的苯硼酸磁性纳米材料，且需要采用解吸液对BR进行解吸，过程相对繁琐。

二是，由于BR的离子化效率不佳，在二级质谱中的诱导碰撞解离(CID)上的碎裂行为不佳，导致其在MS上的信号响应差，灵敏度低。基于此，人们引入化学衍生法，通过信号响应好的硼亲和试剂对BR进行衍生。此步骤往往在萃取之后，即增加了前处理步骤和时间。因为当采用SPE模式对BR进行萃取时，若将衍生萃取同步进行，可能会由于分子间碰撞不充分导致衍生化反应无法充分进行。随后原位衍生技术被提出，此技术能将衍生和萃取步骤同步进行。但依然存在问题：为了保证衍生化反应充分进行，一般会引入相对分析物大大过量的衍生化试剂，而这会对分析物的检测造成干扰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是对现有的油菜素甾醇前处理方法进行改进，提供一种同时具备高灵敏度、高选择性、高通量且简便快速的植物样品前处理方法，实现内源性油菜素甾醇的样品前处理，进而提高分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的灵敏度。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，主要包括以下步骤：

1)在植物样品中定量加入多种内源性油菜素甾醇的同位素内标，然后以溶剂提取，得到样品溶液；

2)将步骤1)所得样品溶液中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料，对样品溶液中的油菜素甾醇进行衍生和同步萃取；其中，所述吸附有硼亲和试剂的固相材料包括硼亲和试剂和固相基体材料两部分，硼亲和试剂与固相基体材料之间依靠强阳离子交换作用与疏水作用结合，硼亲和试剂的结构通式如式1或式2所示：

式1、式2中，Z为苯基或苯甲基，Y为仲胺、叔胺基团，A为季铵盐基团，X为卤素离子；