[发明专利]一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，包括化学发光板、标记抗体、过氧化物溶液、校准品、样品稀释液和洗涤液，其特征在于：所述化学发光板包被有抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体Ⅰ，包被浓度为0.5～0.8ug/ml；

标记抗体为异米鲁诺标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体Ⅱ；所述异鲁米诺的标记过程为：将异鲁米诺溶于盐酸溶液中，加入亚硝酸钠，避光反应15min，得混合液；用硼砂缓冲液调节混合液pH，再加入纯化好的抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体Ⅱ，低温条件下避光反应，透析，得标记抗体，-20℃保存；

所述单克隆抗体Ⅰ和单克隆抗体Ⅱ均属于IgG2a亚类且为配对抗体；

所述校准品是由纯度大于97%的P27蛋白配制的；

所述过氧化物溶液为体积分数为0.06%的过氧化氢水溶液，其中含有0.6g/L的乙酰氨基酚；

所述样品稀释液为10mM的pH值为6.8-7.6的磷酸盐缓冲液，其中含有体积分数为5.0%-15.0%的马血清、体积分数为0.1%-0.5%的曲拉通-100和质量分数为0.05%-0.6%的S9。

2.如权利要求1所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：所述单克隆抗体Ⅰ和单克隆抗体Ⅱ的效价均大于50万。

3.如权利要求1所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：所述校准品为6种由P27蛋白配制的浓度分别0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml和5000ng/ml的溶液。

4.如权利要求3所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：所述校准品由校准品稀释液稀释纯化的P27蛋白制得；所述校准品稀释液为pH值为7.4、浓度为10mM的磷酸盐缓冲液，其中含有50ml/L鸡血清。

5.如权利要求1所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光板的包被过程为：将抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体Ⅰ用包被液稀释至包被浓度，以每孔100ul加入到化学发光板上，将化学发光板置于4℃冷库孵育20h，完成包被，清洗；然后每孔加入150ul封闭液，置于4℃冷库孵育20h，弃去封闭液，拍干，完成封闭；将完成封闭的化学发光板在25℃、湿度低于30%条件下放置18h使其干燥，最后装入放有干燥剂的铝箔袋中。

6.如权利要求5所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：所述包被液为pH为7.4的碳酸盐缓冲液，其中含有0.16g/L碳酸钠和0.29g/L碳酸氢钠；封闭液为含5g/L酪蛋白和50g/L蔗糖的50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液。

7.如权利要求1所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：所述异鲁米诺标记的具体步骤为：将15mg异鲁米诺加入到2.5ml、2M的HCl中，在0～4℃在磁力搅拌器上搅拌溶解，然后加入15mg的NaNO2固体，避光反应15min，反应完毕，得混合液；混合液对刚果红试纸呈蓝色，对碘化钾淀粉试纸显蓝色；然后用0.5M、pH9.6的硼砂缓冲液调节混合液pH为8.5，再加入纯化好的抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体Ⅱ，在0～4℃条件下避光反应24h，完成标记，透析，得标记抗体，-20℃保存。

8.如权利要求7所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：标记抗体的使用浓度以稀释倍数表示，为8000。

9.如权利要求8所述的一种禽白血病病毒的化学发光抗原定量检测试剂盒，其特征在于：标记抗体用标记抗体稀释液进行稀释；所述标记抗体稀释液为含有胎牛血清、Proclin300、海藻糖的50 mM的pH值为7.6-8.5的Tris-Hcl缓冲液；其中，胎牛血清的体积分数为10.0%-50.0%，Proclin300的体积分数为0.1%-0.4%，海藻糖的质量分数为1%-10%。

10.利用如权利要求1-9任意一种所述试剂盒定量检测禽白血病病毒抗原的方法，其特征在于：包括以下步骤：

将化学发光板从铝箔袋中取出，每孔加入样品或校准品50ul，然后每孔再加入50ul标记抗体，37℃温育反应30分钟；

甩掉孔中液体，每孔加洗涤液250ul进行洗涤，然后拍干，重复洗涤；

加过氧化物溶液50ul，将化学发光板置于发光仪上进行读数；

以校准品的浓度为横坐标、校准品的发光值为纵坐标，绘制标准曲线；

将样品的发光值代入标准曲线，计算出样品的实际浓度。