[发明专利]一种抗WSSV感染的胸腺素蛋白Cq‑TRP1在毕赤酵母中的表达与应用

说明书

技术领域

本发明涉及红螯螯虾胸腺素蛋白，尤其是涉及该胸腺素蛋白具有抑制白斑综合征病毒(WSSV)复制的功能，利用基因工程技术，构建红螯螯虾胸腺素蛋白基因表达载体，建立一种具有抗WSSV感染活性的胸腺素蛋白Cq-TRP1在毕赤酵母中的表达及其应用方法。

背景技术

白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是导致虾类养殖尤其是对虾养殖的病源之一，该病毒对水产甲壳动物的经济养殖造成了极大的威胁，因此，提高虾类抗WSSV感染能力是目前研究的重点和难点。目前虾类没有可用于研究的细胞系，这对虾类抵抗WSSV感染的分子机制研究以及后期的防治工作造成了阻碍。红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)是淡水养殖经济虾种之一，其造血组织(Hematopoietic tissue，Hpt)干细胞可体外培养，因此以红螯螯虾作为研究模式虾，通过培养其Hpt细胞开展虾类对抗WSSV感染分子机制的研究具有重要的意义。

胸腺素是由Goldstein和White于1966年首次从胚胎牛胸腺蛋白提取液中发现的含有多种组分的小分子多肽，根据等电点的不同可分为α、β、γ三类，其中β族胸腺素(β-thymosin)是等电点在5.0～7.0之间的一类小分子蛋白^[1]。本专利所述红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)胸腺素蛋白(Thymosin-repeated protein1，TRP1)，命名为Cq-TRP1，其等电点预测值为5.3，系β族胸腺素。β族胸腺素是一种在进化上高度保守的超家族蛋白，含有40～44个氨基酸，分子量约为5kDa左右。β胸腺素是一系列组织和细胞肌动蛋白聚合的有效调节因子，广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物中，其在免疫调节、机体发育等生理活动中发挥重要作用^[2,3]。在大多数哺乳动物中，胸腺素β4是β族胸腺素的主要存在形式，占其总含量的70％-80％。在真核生物中，胸腺素β4是肌动蛋白主要的螯合分子之一^[4]，胸腺素β4具有防止细胞凋亡，促进细胞存活和组织再生等免疫调节功能^[5]。

海洋无脊椎动物的胸腺素与人胸腺素β4具有相似功能，如可以与G-actin单体结合，防止G-actin在纤维状肌动蛋白(F-actin)“+，-”端延伸聚合^[6]。当细胞处于快速运动过程时，需要网状分布的F-actin协调进而快速组装，它又能迅速释放G-actin，提供F-actin合成所需的原料^[7]。研究显示，当红螯螯虾、九孔鲍和棉铃虫等无脊椎动物受到病毒和细菌刺激后，血细胞中胸腺素基因的表达水平明显升高^[8-11]，显示胸腺素可能是重要的免疫因子。宿主的细胞骨架F-actin对于病毒的感染是必不可少的，胸腺素结合G-actin，起到调节的作用，有研究提示胸腺素可能参与机体的抗病毒过程^[12-13]。在棉铃虫精巢细胞中发现胸腺素可以调节F-actin的组装进而改变细胞形态来抵抗AcMNPV(Autographacalifornica M nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)的感染^[14]。根据已有研究，在病毒感染过程中，宿主可能通过调节胸腺素的表达进而调控F-actin的组装以阻碍子代病毒的复制，从而起到协助抗病毒的作用^[15]。因此开展红螯螯虾胸腺素蛋白的表达纯化以及功能方面的研究对WSSV防治有重要意义。

参考文献：

[1]Goldstein A L,Slater F D,White A.Preparation,Assay,and Partial Purification of a ThymicLymphocytopoietic Factor(Thymosin)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1966,56(3):1010.

[2]Gomez-Marquez J,AnadonR.The beta-thymosins，small actinbinding peptides widely expressed in the developing and adultcerebellum[J].Cerebellum,2002,1(2):95-102.