[发明专利]一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA，CMV-DNA，检测结果均为阴性的脐带方可使用；

(2)将脐带剪开，平铺，用PBS缓冲液清洗脐带组织至无血色；

(3)将步骤(2)获得的脐带组织剪成组织段，然后剥离所述组织段的华通胶，并将华通胶置于洁净的器皿中，用手术剪剪成块状；

(4)在步骤(3)获得的块状组织中，先后加入0.1％II型胶原酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心，去掉上清液；

(5)使用含有脐血血浆的培养基重悬步骤(4)获得的细胞沉淀，放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中，加入足量的含有脐血血浆的培养基，置于CO2培养箱内培养；

(6)在培养后的4～5天进行第一次换液，以后3～4天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代；

(7)按6000cells/cm2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于培养瓶中，加入含有脐血血浆的培养基进行培养；

(8)待细胞长至80％融合时，使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多次，然后加入DMEM/F12培养基进行饥饿培养；

(9)收集步骤(8)获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心管中，离心，弃沉淀；

(10)收集步骤(9)获得的上清液，使用5KD的透析袋对干细胞上清进行浓缩，获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子；

(11)在步骤(10)获得的浓缩上清液中加入上清液保护剂，充分混匀后置于4℃保藏。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述组织段的长度为2～4cm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述块状的表面积为1～2mm3。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述消化为先加入0.1％II型胶原酶消化1小时，再加入0.25％胰酶消化0.5小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)所述饥饿培养时间为36-72小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上清液保护剂含有体积比10％的甘油或体积比10％的甘露醇。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上清液保护剂含有体积比5％的甘油和体积比5％的甘露醇。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有脐血血浆的培养基为含有体积比10％的脐血血浆的DMEM/F12培养基。