[发明专利]一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法

说明书

本发明涉及到一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于利用色谱柱和超滤结合的方法，从蚯蚓中提取蚓激酶和蚯蚓蛋白。该方法运用射频技术实现蛋白提取无菌机制，并且控制酶活发生的适宜温度，安全卫生无污染，通过对蚯蚓蛋白的差异性控制实现蚯蚓蛋白的提取和分离，有利于蚯蚓蛋白和蚓激酶的批量生产。

技术领域

本发明涉及一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，特别涉及一种射频技术辅助蚓激酶提取和蚯蚓蛋白酶解的方法。

背景技术

蚯蚓又名地龙，富含蛋白质、氨基酸、微量元素、酶、激素等功能性成份，蚯蚓干蛋白质含量达到70％，是制备药品、化妆品、保健食品等的原料，具有很大的经济价值。蚓激酶是一种具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白水解酶，可以作为治疗血栓类疾病的药物，是国家批准的预防和治疗心脑血管疾病的二类新药，是目前最具有价值的纤溶药物之一。

射频(简称RF)是一种高频交流电磁波，其频率范围为3kHz～300MHz。早在20世纪，射频技术在国外就已经应用于加热肉制品、面包和生产脱水蔬菜，冷冻食品的解冻处理和食品杀菌等领域，射频技术在我国也早有应用，但其应用仅限于工业和医疗，在食品领域应用甚少。利用射频技术的变化电磁波系统提高蚯蚓蛋白提取效率，刺激蚯蚓因激酶的分泌，从而实现蚯蚓激酶和短链多肽的工业化生产。

蚓激酶的提纯方法通常是单一品种盐析，然后通过多种层析，及HPLC、FPLC乃至亲和层析或DEAE离子交换层析、分子筛、凝胶电泳等手段，从不同品系的蚯蚓中获得多种纤溶酶单纯组分，但操作复杂，流程长，处理量小，且酶活力损失很大，又不适合工业化生产。

考虑到蚓激酶是多种有活性组分组成，所以在提取时采用更适合工业化生产的工艺，选择具有生物活性蛋白的分子量空间进行分离，本发明以工业化生产为目的，选择切实可行的工艺路线，可以特异性地从蚯蚓匀浆液中一条线获得蚓激酶、超氧化物歧化酶、其他酶类、蚯蚓多肽，简单易行，提取物有效成分高，适合大规模生产。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种蚯蚓蛋白和蚓激酶提取的方法，该方法具有反应效率高、反应条件可控，同时射频技术的应用可实现灭菌机制，增强酶活酶解速率。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明采用射频技术作为蚓激酶和蚯蚓蛋白提取的辅助技术，在蚯蚓中提取分离蚯蚓蛋白、蚓激酶以及酶解多肽，具体实施步骤如下：(1)取新鲜饱满活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分；

(2)加入4℃预冷的0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液于匀浆器中匀浆5分钟，在4℃冰箱中静置4小时，后高速离心，弃去沉淀，得上清液；

(3)取上清液加固体硫酸铵达35％饱和度，4000r/min，离心10min，收集上清液，再加入固体硫酸铵达70％饱和度，静置过夜，高速离心，收集沉淀，后用0.1mol/L磷酸缓冲液溶解此沉淀物，过滤得粗蛋白溶液；

(4)将粗蛋白溶液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(pH7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，即得蚯蚓蛋白冻干粉；

(5)将蚯蚓蛋白冻干粉加入0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液溶解，两端过20000da‐40000da超滤膜，得截留液A和滤过液B；

(6)将截留液A加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(pH7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，得到冻干蚓激酶；

(7)将步骤(3)所得粗蛋白溶液加入蛋白酶酶解，采用射频辅助酶解，过6000da超滤膜，将滤过液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(pH7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，得到6500da类泛素蚯蚓多肽。