[发明专利]应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀优化方法

权利要求书

1.本发明涉及应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀优化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)破碎裂解

用研钵在-10℃冷冻条件下将组织样本研成粉末，用4℃的PBS溶液洗所述组织样本2-3次；对每1g所述组织样本，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将组织样本裂解液收集到EP管中，加入1ml组织匀浆缓冲液，使用组织匀浆器匀浆30s；将组织悬液置于15℃下，以1000rpm转速离心10分钟；放置3-4分钟，直至裂解液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液4℃，以3000rpm转速离心45分钟，离心去上清；在每1g所述组织样本加入10mM甲醛150ul在摇床上摇晃交联3-5分钟，加200ul终止缓冲液，在摇床上摇晃5-10分钟终止交联；

以重量百分比计，所述裂解液包括0.05-0.2％的氯化铵、0.08-0.1％的氯化钠、0.03-1％的EDTA、0.002-0.01％的deoxicholate、0.002-0.01％的Leupeptin、0.2-1％Tritonx-100和0.02-0.2％蛋白酶K；余下部分为去离子水；

以重量百分比计，所述织匀浆缓冲液包括0.01-0.12％的Tris、0.01-0.1％的氯化钠、0.05-0.5％的NP40、0.002-0.2％的Aprotinin、0.002-0.2％的Leupeptin，余下部分为去离子水；

以重量百分比计，所述终止缓冲液包括0.05-0.20％的氯化钠、0.002-0.02％的碳酸氢铵、0.2-1％Tritonx-100和0.02-0.2％蛋白酶K；余下部分为去离子水；

(2)制备Fe₂O₃@SiO₂-APTS纳米磁珠

1)溶剂热法制备三氧化二铁纳米球，直径为50-100nm；

2)采用法，在所述三氧化二铁纳米球外包覆二氧化硅，得到所述Fe₂O₃@SiO₂纳米球，具体步骤为：称取5重量份步骤1)制备得到的三氧化二铁纳米球，向其中依次加入25重量份去离子水、45重量份无水乙醇和10重量份质量分数为5-15％的氨水，超声混合均匀后向混合液中加入10重量份正硅酸乙酯，25℃下机械搅拌1小时；反应完毕后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗2-3次，将所得产物在50℃-75℃烘箱中干燥待用；

3)使用硅烷偶联剂氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷对步骤2)获得的Fe₂O₃@SiO₂纳米球进行硅烷化处理，得到Fe₂O₃@SiO₂-APTS；所述硅烷化具体步骤为：以细胞样本为100重量份：称取5重量份步骤2)得到的Fe₂O₃@SiO₂纳米球，加入到25重量份二甲基甲酰胺中，超声分散后得到溶液A；将15重量份的氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷和25重量份的二甲基甲酰胺混合均匀后，加入丁二酸酐使得混合溶液pH值维持在4-5，在50℃-75℃下机械搅拌3小时，得到溶液B；将所述溶液A、B混合后加入30重量份去离子水，在50℃-75℃下继续机械搅拌1小时后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得硅烷化的Fe₂O₃@SiO2-APTS纳米磁珠；

(4)结合抗体

对应每1g所述组织样本，取1.5ug组蛋白修饰抗体，在4℃条件下孵育20小时，然后用30-50ul10mMTris-HCl溶液洗涤3次，以1000rpm转速离心5分钟，取上清，转至低吸附的离心管中，加入所述Fe₂O₃@SiO₂-APTS纳米磁珠，置于4℃条件下旋转，孵育3-5小时，保证所述Fe₂O₃@SiO₂-APTS纳米磁珠和组蛋白修饰抗体充分复合；

(5)免疫共沉淀

对应每1g所述组织样本，在装有所述组织样本裂解液EP管中加入25μl所述Fe₂O₃@SiO₂-APTS纳米磁珠-抗体复合物，置于4℃条件下旋转，孵育3-5小时，让目标组蛋白与所述Fe₂O₃@SiO₂-APTS纳米磁珠-抗体复合物结合；将所述组织样本裂解液EP管放在磁力架上，吸去上清；

(6)洗脱

对应每1g所述组织样本，在装有所述组织样本裂解液EP管加入20μl的100mM氯化钠溶液，轻轻重悬所述Fe₂O₃@SiO₂-APTS纳米磁珠-抗体复合物；40-50℃水浴加热10分钟；将所述EP管放在磁力架上，去除上清，用200ul4℃的0.5mMEDTA溶液洗涤1-2次，用200ul350mM氯化钠溶液洗涤2-3次，用200ul50mMTris-HCl溶液洗涤2-3次，以上洗涤每次10-15分钟；加50ul洗脱缓冲液在37℃洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ug蛋白酶K，在50-75℃条件下解交联过夜；用150ul所述洗脱缓冲液在37℃洗脱所述Fe₂O₃@SiO₂-APTS纳米磁珠-抗体复合物20-30分钟，溶出DNA；

以重量百分比计，所述洗脱缓冲液包括5-15％的氯化镁、10-20％的氯化钠、20-25％的乙二醇、0.001-0.01％的硫氰酸钠和0.5-0.2％SDS；余下部分为去离子水。