[发明专利]一种NKT细胞冻存液及其制备方法

说明书

本发明公开了一种NKT细胞冻存液及其制备方法，该冻存液包括以下组分：人血白蛋白注射液、二甲基亚砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理盐水注射液、车前草提取液、苦荞黄铜、银耳多糖、海带多糖和羟乙基淀粉。该冻存液冻存液中不含有动物源血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。其冻存液配方简单，各组分相互配合，协同作用可保持冻存复苏后细胞状态基本接近冻存前的状态，活力也较高，可明显提高NKT细胞的冻存效果。

技术领域

本发明属于细胞冻存液技术领域，具体涉及一种NKT细胞冻存液及其制备方法。

背景技术

NKT(natural killer T)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。近几年在NKT细胞的表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病的关系、肿瘤治疗和自身免疫性治疗等方面的研究有了很大的发展。由于NKT细胞在肿瘤及免疫性疾病治疗等方面的研究也决定了NKT细胞培养后冻存的重要性，在治疗方面可以避免延时培养造成的细胞活性低，在经济方面，避免了延时培养造成的成本增加，在研究方面，可将不同时期的NKT细胞冻存起来，研究其不同冻存时间的NKT细胞的活性。

但目前，通常采用添加不同比例的胎牛血清和二甲基亚砜配制成的冻存液来冻存NKT细胞，但添加二甲基亚砜只是为了从冻存过程中防止胞内冰晶的形成损伤细胞，而添加胎牛血清是为了保护细胞不受二甲基亚砜的损伤，同时还为细胞提供营养。但是胎牛血清属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合临床应用，特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起未知的不良反应，严重影响治疗结果。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种NKT细胞冻存液及其制备方法，该冻存液临床安全性高，同时又能很好的保持冻存细胞的活性。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种NKT细胞冻存液，包括以下组分：人血白蛋白注射液、二甲基亚砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理盐水注射液、车前草提取液、苦荞黄酮、银耳多糖、海带多糖和羟乙基淀粉；其中，人血白蛋白注射液、二甲基亚砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理盐水注射液的体积比为15-25：8-15：6-10：5-10：5-10；车前草提取液、苦荞黄酮、银耳多糖、海带多糖、羟乙基淀粉的浓度分别为5-15mg/ml、1-4mg/ml、1-5mg/ml、2-4mg/ml和15-20mg/ml。

进一步地，人血白蛋白注射液、二甲基亚砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理盐水注射液的体积比为20：12：8：8：8。

进一步地，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。

进一步地，车前草提取液、苦荞黄酮、银耳多糖、海带多糖、羟乙基淀粉的浓度分别为8mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、3mg/ml和18mg/ml。

进一步地，车前草提取液取通过以下方法制备得到：取车前草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-3:1混合，然后进行CO₂超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入5-6倍重量的蒸馏水，在90-95℃加热6-8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得车前草提取液。

上述NKT细胞冻存液的制备方法，包括：

(1)将二甲基亚砜、聚乙二醇和羟乙基淀粉混合，得溶液A；

(2)将葡萄糖注射液和生理盐水注射液混合，然后加入车前草提取液、苦荞黄酮、银耳多糖和海带多糖，混匀，得溶液B；

(3)将溶液A和溶液B混合，再加入人血白蛋白注射液中，混匀，制得。

本发明提供的NKT细胞冻存液及其制备方法，具有以下有益效果：