[发明专利]应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC-seq方法

说明书

本发明涉及应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC‑seq方法，包括细胞悬液制备、转座反应与纯化、去除杂质、PCR扩增、高通量测序、概率检测。该方法采用转座酶法进行DNA片段化，将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应，缩短实验时间。可以快速的得到调控的多维信息，比其他方法要节省大约3到5个数量级的细胞。实验流程中没有片段选择的步骤，所以这种方法可以同时获得“开放”染色质的位置、转录因子的结合位点、核小体的调控区域和染色质状态等信息。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC-seq方法。

背景技术

近些年来，“大数据”这个词汇已经成为当下最常见的词汇之一，而自从上世纪90年代开始，生物信息学经过多年的发展，已经从最初的DNA序列分析和蛋白质序列分析，扩展到生物学的各个领域，使得生物学数据的增长惊人，生物学现在也已经进入了“大数据”时代。

ATAC-seq技术由ATAC实验和高通量测序两部分组成，它是分子生物学研究染色质可接近性的技术。该技术在2013年首次被提出，作为MNase-seq、FAIRE-seq和DNase-seq的替代或补充方法。ATAC-seq实验的关键部分是转座酶Tn5对样品基因组DNA的作用。ATAC-seq采用突变的多活性转座酶，允许高效切割暴露的DNA和同时连接特定序列的接头。分离接头连接的DNA片段，通过PCR扩增后用于高通量测序。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC-seq方法。

为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC-seq方法，包括以下步骤：

步骤一：细胞悬液制备：

制备含有2×106～5×106个细胞的细胞沉淀，将细胞沉淀在4℃下匀浆500g中离心10min后得到混合物M，将混合物M用预冷的PBS缓冲液洗涤后得到混合物A；PBS缓冲液包括：200mM NaCl，3mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.1wt％吐温－20，PBS缓冲液的PH值为7.4；

步骤二：转座反应与纯化：

在混合物A中加入25ul TE缓冲液、2.5ul Tn5转座酶和22.5ul DEPC处理水，在37℃水浴中反应30min得到混合物B；TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl，PH＝8.0，1mM EDTA，PH＝8.0；

在混合物B中加入2.5ul溴化乙锭溶液，轻轻摇匀15min后，再在4℃下匀浆500g中离心15min得到混合物C；

在混合物C中加入与混合物C等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液得到混合物D；氯仿醇溶液包括：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1；

在混合物D中加入无水乙醇后静置沉淀，得到纯化DNA；混合物D和无水乙醇的体积比为1:2；

步骤三：去除杂质：

在纯化DNA中加入Washing buffer，轻度漂洗1～5min后倒出漂洗后的Washingbuffer，得到混合物E；