[发明专利]表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、高亲和性Her2单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。本发明制备的嵌合抗原受体能够靶向Her2，提高CAR‑T细胞治疗效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用。

背景技术

表皮生长因子2(Her2)是重要的促癌基因，在多种肿瘤中高表达，是一种较好的肿瘤治疗靶点。利用转基因技术，将识别Her2的嵌合抗原受体(CAR)序列转导入T细胞中，能够产生识别特异靶点Her2、杀伤肿瘤细胞的CAR-T细胞。CAR-T细胞治疗在血液系统肿瘤中展示了良好效果，但在实体肿瘤中的效果却难以令人满意。CAR-T细胞在实体瘤治疗中出现的短板与以下4个问题有关：1、转基因序列能否在T细胞中高效表达；2、转基因CAR序列是否具有较强亲和力，能够高效识别靶抗原；3、CAR中的连接片段是否能够高效将胞外识别区信号传递给胞内活化区以启动T细胞杀伤；4、CAR活化后是否会导致T细胞迅速无能乃至耗竭。

发明内容

本发明主要提供了一种表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体能够靶向Her2，提高CAR-T细胞治疗效果。其技术方案如下：

一种表达Her2的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、高亲和性Her2单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。

优选的，所述人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述高亲和性Her2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述人CD8a分子柔性片段与跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述人41BB分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种核酸序列，所述核酸序列用于编码上述嵌合抗原受体，所述核酸序列如SEQID NO.7所示。

一种慢病毒表达载体，所述载体载有上述嵌合抗原受体。

优选的，所述嵌合抗原受体为在pCDH-EF1-MSC质粒中表达，形成pCDH-EF1-CAR-her2BBz制粒。

一种慢病毒，所述慢病毒为将上述慢病毒表达载体与包装制粒psPAX2和pMD2.G共转染靶细胞得到。

上述嵌合抗原受体在制备识别特异靶点Her2的CAR-T细胞中具有医学上的应用。

采用上述方案，本发明具有以下优点：

(1)CAR主要由3部分构成：胞外识别区、信号转导区和胞内信号区。其中，胞外识别区决定了CAR-T细胞杀伤的特异性，往往由scFv序列构成，我们选择了高亲和性识别Her2的scFv序列(Her2scFv)，能够高效识别靶细胞。胞内信号区也是决定CAR-T细胞治疗效果的重要结构，我们通过加入41BB信号域，显著提高了CAR-T细胞扩增与生存。此外，信号转导区的结构选择也影响CAR-T细胞功能。我们利用CD8铰链区与跨膜区序列保证胞外识别区与胞内信号区之间有了很好的结合，保证了CAR-T细胞的功能。

(2)在传统制备过程中，用于治疗的CAR-T细胞往往处于终末分化阶段，生存时间较短、难以发挥长效杀伤功能，因而治疗效果较差。而我们采取的41BB共刺激信号显著抑制T细胞终末分化，促进具备更长生存时间的记忆型T细胞生成。此类转基因修饰的CAR-T细胞具备更强、更持久的杀伤能力，有望提高实体瘤治疗效果。

附图说明

图1为Her2-CAR结构示意图；