[发明专利]一种高背景下沙门氏菌的检测方法

说明书

本发明提供了一种高背景下沙门氏菌的检测方法，所述方法将免疫磁珠法与数字PCR方法相结合，合成了纳米级免疫磁珠，优化了免疫磁珠捕获及分离沙门氏菌的条件，确立了沙门氏菌数字PCR检测体系，优化了检测条件，并在乳品发酵剂高背景条件下进行了验证。本发明实现了3h内对浓度为103CFU/mL沙门氏菌的检出，在乳品发酵剂中进行检测验证，可实现107CFU/mL乳酸菌背景下103CFU/mL沙门氏菌的检出。

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，特别涉及一种高背景下沙门氏菌的检测方法。

背景技术

沙门氏菌是危害很大的食源性致病菌，沙门氏菌是一种兼性厌氧型的革兰氏阴性菌，属肠杆菌科，两端钝圆，菌体大小是(0.4～0.9)μm×(1～3)μm，生长温度范围为5～46℃，最适生长温度为35～37℃。最适生长pH为6.5～7.5。我国国家食品药品监督管理总局2015年发布第12期《食品安全风险解析》中特别强调了沙门氏菌的危害与其可能引起的食品安全隐患。由沙门氏菌引起的食源性疾病居细菌性食源性疾病的首位。2006～2010年间报告的细菌食源性疾病暴发事件中，70％～80％是由沙门氏菌所致。

直到20世纪90年代，大多数疾病是由于消费动物性产品：家禽，家禽产品，肉类和乳制品。最近越来越多的疾病已经与食用生的食物、新鲜的即食食品有关，如西红柿，甜瓜，豆芽菜，绿叶蔬菜及浆果等。美国的几项流行病学研究表明，在大多数情况下，污染商品的沙门氏菌数量相对较少，但仍会引发疾病爆发。因此，快速、准确的检测食物、食品发酵剂以及环境来源的沙门氏菌至关重要，可有效维护食品安全，确保公众健康。在过去的25年，开发更快捷的方法用于检测、识别在食物和环境样品中不同亚型的沙门氏菌一直是研究的热点所在。

已有的传统检测沙门氏菌的方法包括：国标GB4789.4-2010《食品微生物学检验-沙门氏菌检验》中采用传统法进行沙门氏菌的检测，此方法步骤繁琐，操作复杂。免疫学检测法，根据酶联免疫吸附测定原理研发了多种试剂盒，检测沙门氏菌一般也采用商业化的试剂盒，病原体的检出限(LOD)通常在104～105CFU/mL的范围内，测定时间可能需要大约48h，因为通常需要预富集步骤以达到细菌的检出限。虽然易于操作，但大多数替代检测方法均需要24h预浓缩，以增加目标细菌的数量使之达到检测限。

另外，乳品发酵剂因其成分较为特殊，主要由高浓度的乳酸菌菌体组成，在菌体形态、菌种生长特性等诸多方面，均与沙门氏菌存在一定的相似度，单纯的采用免疫学的方法易出现较高比例的假阳性，而单纯采用分子生物学的检测方法则因高背景乳酸菌的影响，使得在DNA提取及后续检测均困难重重。

乳品发酵剂在生产过程中的培养温度在37℃，而沙门氏菌的最适生长温度也在37℃左右，一旦被其污染，沙门氏菌将在营养丰富的培养基中大量繁殖，消耗体系中的大量营养物质，改变发酵剂的成分体系，使得发酵剂体系酸度上升，并产生气体，使得发酵剂品质异常，严重影响产品安全性。被污染的乳品发酵剂一旦用于后续乳制品生产中将引起严重的安全性问题，引发一系列的疾病。及时监测可较早的控制发酵剂的污染情况，防止发酵剂工厂面临较大损失。

体系中出现污染致病菌的现象如果检测用时较长，将导致污染十分严重不可逆转，工厂都会选择弃掉所有有问题的发酵剂，以保证发酵剂的品质，这对工厂带来的损失是十分巨大的。因此，采用快速的检测发酵剂中致病菌的方法十分重要。

为了获得较好品质的发酵剂，对生产环节发酵剂的品质监测至关重要。而检测手段的快速、便捷、灵敏则较大程度上保证了对生产过程的控制。能及时对出现问题的发酵剂进行处理可减少生产企业的损失，降低风险水平。安全稳定的乳品发酵剂品质也为后续产品的推广和应用夯实了基础，为应用乳品发酵剂的下游企业提供了保障。