[发明专利]基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、人源间皮素单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。本发明制备的嵌合抗原受体能够靶向间皮素，提高CAR‑T细胞治疗效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用。

背景技术

间皮素(mesothelin)在多种肿瘤中高表达，是一种较好的肿瘤治疗靶点。利用转基因技术，将识别间皮素的嵌合抗原受体(CAR) 序列转导入T细胞中，能够产生特异识别间皮素、杀伤肿瘤细胞的 CAR-T细胞。CAR-T细胞治疗在血液系统肿瘤中展示了良好效果，但在实体肿瘤中的效果却难以令人满意。CAR-T细胞在实体瘤治疗中出现的短板与以下3个问题有关：1、CAR-T细胞识别区的来源是人源或是其他物种；2、CAR中的连接片段是否能够高效将胞外识别区信号传递给胞内活化区以启动T细胞杀伤；3、CAR活化后是否会导致T细胞迅速无能乃至耗竭。

发明内容

本发明主要提供了一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体能够靶向间皮素，提高 CAR-T细胞治疗效果。其技术方案如下：

一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、人源间皮素单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。

优选的，所述人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述人源间皮素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述人CD8a分子柔性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述人CD28分子跨膜区与胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述人41BB分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述人 CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种核酸序列，所述核酸序列用于编码上述嵌合抗原受体，所述核酸序列如SEQID NO.8所示。

一种慢病毒表达载体，所述载体载有上述嵌合抗原受体。

优选的，所述嵌合抗原受体为在pCDH-EF1-MSC质粒中表达，形成pCDH-EF1-CAR-meso28BBz制粒。

一种慢病毒，所述慢病毒为将上述慢病毒表达载体与包装制粒 psPAX2和pMD2.G共转染靶细胞得到。

上述嵌合抗原受体在制备靶向间皮素的CAR-T细胞中具有医学上的应用。

采用上述方案，本发明具有以下优点：

(1)CAR主要由3部分构成：胞外识别区、信号转导区和胞内信号区。其中，胞外识别区决定了CAR-T细胞杀伤的特异性，往往由scFv序列构成，但很多scFv序列是小鼠来源的，会造成较强的免疫排斥反应，导致CAR-T细胞治疗无效。而我们选择了高亲和性识别间皮素的人源scFv序列(anti-meso scFv)，既能够有效避免免疫排斥，又能够高效识别靶细胞。胞内信号区也是决定CAR-T细胞治疗效果的重要结构，我们通过加入CD28和41BB双信号分子，显著提高了CAR-T细胞的功能与扩增。信号转导区的结构选择也影响 CAR-T细胞功能。我们利用CD8铰链区保证胞外识别区与信号区之间有了很好的结合，保证了CAR-T细胞的功能。此外，我们还添加了CD28与41BB双刺激分子结构，既保证了T细胞杀伤能力，还能维持T细胞增殖。