[发明专利]一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法

说明书

本发明公开一种应用人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域(Fn3)展示两个抗原表位用于制备抗原替代物的方法。该方法通过基因重组，分别将编码抗原的两个表位碱基序列重组在编码Fn3基因序列的FG loop区和3′端，构成Fn3与双抗原表位融合基因。利用大肠杆菌表达系统高效、快速地表达和制备Fn3展示双抗原表位的融合蛋白。本发明的有益效果是可以简单、快速、高效制备具有展示双抗原表位的抗原替代物，为生产相应的免疫学检测建立技术平台。

技术领域

本发明属于基因工程领域和蛋白质工程领域，具体是一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法。

背景技术

人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域(简称Fn3)是一类能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠及三级结构不变的骨架蛋白，具有稳定性高、可溶性高的特点，可在大肠杆菌中高水平表达。Fn3作为一个小的独立折叠单元，不含半胱氨酸和二硫键，由四条β-折叠和一条α-螺旋组成；其片段之间形成三个loop区域(BC loop区、DE loop区及FG loop区)。经大量研究表明FGloop区具有较高的灵活性，其突变或缺失对于骨架蛋白Fn3的结构和稳定性影响不大。此外，Fn3还具有非常高的热稳定性(Tm值高达87℃)；室温条件下，在pH值2-11.3的范围内仍能保持蛋白质的天然构象。Fn3的结构特点为以其为基础合成稳定的人工结合蛋白提供了良好的条件，非常适合作为融合蛋白在大肠杆菌中表达纯化。以上特点为基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位提供可能。

抗原表位(Antigenic epitope)，又称抗原决定簇(Antigenic determinant，AD)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。抗原表位通常是指外来蛋白质等物质的其中一部分序列。针对蛋白质类抗原的抗原表位一般仅由几个到十几个氨基酸组成。在应用酶联免疫吸附剂测定(简称ELISA)检测蛋白质类抗原含量时，需要有被检测的蛋白抗原作为标准物，通常采取双抗体夹心法来进行检测。其中一个抗体作为捕获抗体，固定在固体表面；另外一个抗体用酶或荧光标记，作为检测抗体。蛋白质类抗原，特别是小分子肽类普遍存在不稳定，容易降解，制备成本较高等特点。例如脑钠肽前体N端部分(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)是心肌细胞在合成多肽类激素B型脑钠肽(BNP)过程中产生的无生物活性的、由76个氨基酸组成的直链多肽片段。心衰患者血液中BNP以及NT-proBNP两种多肽的浓度与心衰严重程度成正比，心衰患者血浆BNP浓度可增至几个ng/mL，而NT-ProBNP可高达几十个ng/mL。NT-proBNP生物半衰期为60-120分钟，相比生物半衰期仅为20分钟的BNP要长的多，目前国际上已经公认NT-ProBNP是测定心衰的一个特异性标志物。但是多肽NT-proBNP作为抗原标识物，其分子量小(76个氨基酸)，只有8.45kD，且不稳定，分离和纯化难度也大，同时易降解。所以，需要通过基因重组方式，将编码目标蛋白质类双抗原表位序列重组在一个稳定的蛋白质基因序列中，例如Fn3为非常稳定的蛋白质，利用大肠杆菌可大量表达该稳定蛋白质，将目标蛋白质表位展示在稳定的Fn3重组蛋白上，作为相应蛋白抗原替代物具有重要的研究价值。

本发明采用人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域(Fn3)，通过展示脑钠肽前体N端NT-proBNP双抗原表位，高效生产稳定的抗原蛋白替代物，提供解决蛋白质类抗原制备难的方法，为制备免疫学检测标准品提供有效途径。

发明内容

本发明为解决蛋白质类抗原制备难的问题，提供一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法，为制备免疫学检测标准品提供有效途径。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)通过基因重组，构建能在大肠杆菌中表达人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位的重组蛋白表达载体；