[发明专利]一种制备抗癌胚抗原的纳米抗体的方法

说明书

本发明提供了一种制备抗癌胚抗原的纳米抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)扩增癌胚抗原纳米抗体的编码基因；(2)将步骤(1)获得的编码基因连接于表达载体pKLAC2；(3)将步骤(2)获得的载体转导入宿主细胞乳酸克鲁维酵母中；(4)诱导步骤(3)获得的宿主细胞，收获表达的抗癌胚抗原的纳米抗体。本发明还提供了含有抗癌胚抗原纳米抗体的表达载体和含有该载体的宿主细胞乳酸克鲁维酵母。采用本发明所述的方法，使得表达的纳米抗体分泌到细胞外，杂蛋白较少，Western Blot检测目的条带单一，从而降低了分离纯化的成本，而且大大提高了表达的效率；其中在摇瓶培养的条件下，胞外分泌量为0.8mg/l，通过直接偶联法测得抗癌胚抗原的纳米抗体亲和力为5.042×10^‑9。

技术领域

本发明涉及一种抗体蛋白的制备方法，更具体地涉及一种使用乳酸克鲁维酵母制备纳米抗体蛋白的方法。

背景技术

癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种分子量约为180kDa的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一员，最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌以及甲状腺癌等癌症中检测到。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原，同时CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。

目前，CEA已经成为靶向治疗的潜在肿瘤相关抗原。CEA靶向免疫治疗癌症有2种方式，一种方式是使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞；另一种方式是通过抗CEA抗体或抗体片段与药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。

1993年比利时科学家研究发现，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH₂与CH₃区。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量约为15kDa，10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体。此外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体。相对于传统的四链抗体而言，纳米抗体在亲和力与传统抗体相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作等诸多方面优于传统抗体。

考虑到工业应用上的简便和高效，目前多采用在大肠杆菌中表达纳米抗体的方法，但是，这种表达方法的缺点在于抗体不能进行糖基化的修饰，其次是纳米抗体中会含有内毒素，这些缺点都限制了纳米抗体在制约学和临床医学上的应用。而对于将毕赤酵母作为表达宿主菌，虽然也能成功地表达分泌纳米抗体，但是由于在纳米抗体表达的过程中，需要甲醇作为诱导剂，由此带来了一定的弊端：一是甲醇加入过量会对酵母本身产生一定的毒性，从而影响纳米抗体的产量；二是甲醇本身是不符合食品与药品安全级别的，且后续需要对甲醇进一步的去除，操作起来比较复杂。酿酒酵母表达系统存在发酵密度不高，分泌表达能力较差以及过度糖基化等。综合多方面考虑，产物能否分泌到胞外、产物的稳定性、是否会出现特殊的副产物、食品和药物的安全级别等方面，乳酸克鲁维酵母是酵母表达系统中最好的选择。目前，已有一些药用蛋白表达成功并得到了应用。

乳酸克鲁维酵母是生物技术科学领域非常重要的酵母之一，在食品安全应用行业和工业规模化生产酶方面具有重要意义。乳酸克鲁维酵母作为蛋白表达系统已在食品行业得到应用。由于纳米抗体在分子量、空间结构等方面的独特特点，相对于传统的乳酸克鲁维酵母表达存在一定的难度，目前尚未在酵母细胞中表达抗癌胚抗原(Anti-CEA)的纳米抗体的报道。但是鉴于乳酸克鲁维酵母作为工程菌，最重要的一点是该菌是经美国食品与药品管理局(FDA)及中国卫生部确定了的能够达到食品安全级别的可食用酵母，且不需要消除特殊的副产物的优点，如果能够实现抗癌胚抗原的纳米抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达，则可以为该蛋白在工业化制备方面，以及未来在制药和诊断制剂领域的应用奠定基础。

发明内容