[发明专利]TAT-hEGF融合蛋白的制备及其在隐形面膜的应用

权利要求书

1.一种温敏无基布生物活性隐形面膜的制备方法，其特征在于：每100毫升所述隐形面膜由以下组分制成：泊洛沙姆407 18-20克、甘油5-7毫升，透明质酸0.5-2克、TAT-hEGF融合蛋白 0.02-0.2克、尿囊素0.2-2克、薄荷醇0.5-2克、苯氧乙醇0.8毫升、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.05克，其余为去离子水；

所述TAT-hEGF融合蛋白通过以下方法制备：

1)人工合成编码TAT-hEGF融合蛋白的DNA序列，TAT序列位于hEGF的氨基段，TAT和hEGF序列之间由3个甘氨酸序列组成的linker相连接，在基因的上游引入XhoI位点和Kex2切割位点Glu-Lys-Arg序列，在基因的下游引入终止密码子和XbaI位点；

2)构建TAT-hEGF融合蛋白的表达盒，所述的表达盒依次包括Kex2信号切割位点编码序列、TAT跨膜肽编码序列、linker序列和人表皮生长因子的编码序列，如SEQ IDNO：1所示；

3)构建表达载体，分别用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切合成的基因片段及载体pPICZα，构建pPICZα-TAT-hEGF重组质粒，所述pPICZα能被宿主细胞毕赤酵母X-33高效表达；

4)表达与纯化TAT-hEGF融合蛋白，将获得的pPICZα-TAT-hEGF重组质粒使用核酸内切酶Pme I线性化后，电转化毕赤酵母，而后筛选获得高表达TAT-hEGF融合蛋白的菌株，确定最佳诱导条件和时间，取发酵上清液使用40％的饱和硫酸铵沉淀蛋白，而后用阳离子交换层析，利用0.3mol/L的NaCl-30mmol/L醋酸-醋酸钠且pH为5.2的洗脱液洗脱TAT-hEGF融合蛋白，获得纯度大于95％的TAT-hEGF融合蛋白，所述最佳诱导条件和时间具体为：随着诱导的延长，第6天时表达量达到峰值，最佳诱导PH值为4.6；

5)鉴定TAT-hEGF融合蛋白，并检测其生物活性；

该隐形面膜在组成成分的协同作用下，可使生物活性物质透过角化的表皮直达皮肤的真皮层。

2.一种温敏无基布生物活性隐形面膜，其特征在于：每100毫升所述隐形面膜由以下组分构成：泊洛沙姆407 18-20克、甘油5-7毫升，透明质酸0.5-2克、TAT-hEGF融合蛋白 0.02-0.2克、尿囊素0.2-2克、薄荷醇0.5-2克、苯氧乙醇0.8毫升、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.05克，其余为去离子水；

所述隐形面膜采用如权利要求1所述的方法制备，该隐形面膜在组成成分的协同作用下，可使生物活性物质透过角化的表皮直达皮肤的真皮层。