[发明专利]一种视网膜色素上皮细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种视网膜色素上皮细胞的培养方法，其包括以下步骤：(1)将视网膜色素上皮细胞按照3×10⁴‑4×10⁴/cm²的密度接种于细胞板或细胞瓶中；(2)所述细胞培养230‑250小时后，消化；使用所述方法，视网膜色素上皮细胞在冻存复苏后具有高细胞活性。

技术领域

本发明总体上涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种人视网膜色素上皮细胞的培养方法。

背景技术

RPE是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其筛子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，例如吞噬消化脱落的光感受器细胞的外节(OS)、促进视循环中重要的介质11-顺式视黄醛的再生、调节眼内的免疫反应、参与形成视网膜-血管屏障等。RPE细胞的这一生理功能的异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，例如RPE细胞屏障功能异常则易导致Best卵黄样黄斑营养不良(Bestvitelliform macular dystrophy，BVMD)和成人卵黄样黄斑营养不良(adult-onsetvitelliform macular dystrophy，AVMD)。RPE基底膜与Bruch’s membrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和Sorsby’s眼底营养不良的发生相关。

原代培养出的成纤维细胞呈短梭形、多角形或不规则形；体外培养连续多次传代后获得形态较均一的成纤维细胞，以梭形为主，细胞呈放射状排列。目前市场上存在的视网膜色素上皮细胞培养工艺一般在30-60天左右，周期很长，需要消耗大量培养基；且冻存复苏后的人视网膜色素上皮细胞，其色素分布很不均一，分化程度很不一致。因此在临床应用上，人视网膜色素上皮细胞特有功能不仅损失较大，临床效果也不好。

由于普通的方案，例如台盼蓝染色不能有效分选出具有临床高活性的的细胞，因此，提供在不影响细胞功能的前提下可大幅度提升冻存细胞复苏后的存活率的新方法，将对人类视网膜色素上皮细胞的研究提供理论支持，对细胞的传代、制备、研究以及对最终临床效果的保证提供了便利。

发明内容

本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞(RPE)的培养方法，其包括以下步骤：

(1)将视网膜色素上皮细胞按照3×10⁴-4×10⁴/cm²的密度接种于细胞板或细胞瓶中；

(2)所述细胞培养144小时至250小时之间后，消化；

使用所述方法，视网膜色素上皮细胞在冻存复苏后具有高细胞活性。

在一个实施例中，所述视网膜色素上皮细胞为原代来源的人视网膜色素上皮细胞。

在一个具体实施例中，所述细胞板为细胞培养六孔板。

在一个具体实施例中，所述视网膜色素上皮细胞细胞的接种量为3×10⁵/孔。

在一个实施例中，所述细胞培养时间为144-250小时，优选230-250小时，更优选为235-245小时，最优选为240小时。

在一个实施例中，前述的方法还包括以下步骤：

(3)将消化后的细胞冻存；

(4)复苏细胞。

在一个具体实施例中，前述方法还包括以下步骤：

(5)计算细胞冻存复苏后的贴壁率，所述细胞的冻存复苏后贴壁率≥80％，优选≥90％时，该细胞可作为合格细胞进行后续使用。

在一个具体实施例中，所述细胞的冻存复苏后贴壁率优选≥95％。