[发明专利]构建细胞全转录本扩增产物的方法及其应用

权利要求书

1.一种构建细胞全转录本扩增产物的方法，其特征在于，包括：

将细胞样品进行磁珠捕获处理，以便获得待处理细胞；以及

将所述待处理细胞进行单细胞全转录本扩增，以便获得所述待处理细胞的全转录本扩增产物，其中，进行单细胞全转录本扩增之前，进一步包括将所述待处理细胞进行裂解处理，所述裂解处理是通过向所述待处理细胞中加入PBS和裂解液进行的，基于1～100个待处理细胞，所述PBS的用量为7微升，所述裂解液的用量为4微升，所述裂解液包括100mM Tris-HCl、500mM KCl、25mM MgCl₂、10％NP40、0.1M DTT、40U/μl的RNA酶抑制剂、0.5μM UP1引物、2.5mM dNTP以及无核酸酶水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞样品来源于外周血；

任选地，所述外周血为肿瘤患者外周血；

任选地，所述待处理细胞为循环肿瘤细胞；

任选地，所述裂解处理包括用移液器对所述待处理细胞进行吸打重悬处理至少5次。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磁珠捕获处理是通过如下方式进行的：

1)将5mL外周血与100μL磁珠进行第一混合，所述磁珠预先利用PBS进行第一重悬处理，所述第一混合是在5rpm的条件下进行30min；

2)将所述第一混合产物在磁力架上静置3min，以便除去第一上清；

3)将步骤2)所得沉淀进行第二重悬处理，所述第二重悬处理是在5ml PBS中进行的；

4)将第二重悬处理产物在磁力架上静置1min，以便除去第二上清；

5)重复步骤3)和4)两次；

6)将步骤5)所得沉淀进行第三重悬处理，所述第三重悬处理是在1ml PBS中进行的；

7)将第三重悬处理产物在磁力架上静置1分钟，以便获得所述循环肿瘤细胞；

其中，所述磁珠包被有识别所述循环肿瘤细胞的抗体；

任选地，所述抗体包括EpCAM、Her2的至少之一。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单细胞全转录本扩增是通过如下方式获得的：

1)将循环肿瘤细胞在24℃的条件下进行裂解5分钟，随后在95℃的条件下裂解3分钟，冷却至4℃；

2)将步骤1)获得的裂解产物在磁力架上静置1分钟，吸取第三上清；

3)将步骤2)所获得第三上清与2μl gDNA Wipeout Buffer进行混合，所述混合是在42℃的条件下进行10分钟；

4)将步骤3)所获得产物与6μl Quantiscript RT mix进行混合，所述混合是在42℃的条件下进行60分钟；

5)将步骤4)所得产物在95℃的条件下孵育3分钟，放冰上冷置；

6)在步骤5)所得产物与10μl的ligation mix混合，所述混合是在24℃条件下进行30分钟；

7)将步骤6)所得产物在95℃条件下静置5分钟，放冰上冷置；

8)将步骤7)所得产物与30μl的REPLI-g SensiPhi amplification mix进行混合，所述混合是在30℃条件下进行2h；

9)将步骤8)所得产物在65℃的条件下孵育5分钟；

10)将步骤9)所得产物进行纯化处理，以便获得所述循环肿瘤细胞基因组全转录本扩增产物。

5.一种检测细胞中预定因子的方法，所述方法用于非疾病诊断或治疗目的，其特征在于，包括：

按照权利要求1～4任一项所述的方法构建细胞全转录本扩增产物；以及

基于所述全转录本扩增产物进行针对预定因子的PCR扩增，以便检测所述细胞中预定因子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞为前列腺癌循环肿瘤细胞；

任选地，所述预定因子为AR-V7。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增为ddPCR扩增，ddPCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1～2所示。