[发明专利]一种恒温固相重组杂交方法

权利要求书

1.一种恒温固相重组杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；

(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；

(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；

(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；

(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；

(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；

(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。

2.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用多聚酶链式反应或恒温核酸扩增法扩增待测靶标核酸序列。

3.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述固相介质包括塑料板、玻璃片或硝酸纤维素膜。

4.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述固相介质表面包括鲑鱼精子DNA、封闭剂和抗菌剂中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用水化溶液水化步骤(2)中的固相介质表面，所述水化溶液由下述浓度的组分构成：硫酸葡聚糖10～20wt％和PBS缓冲液10mM。

6.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述探针为DNA寡核苷酸探针。

7.根据权利要求6所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述DNA寡核苷酸探针的长度为20～50nt且在5’端带有60个多聚T核苷酸；所述DNA寡核苷酸探针经254nm紫外线辐照10min，辐照强度为0.3J/cm2，固化在固相介质表面。

8.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述标记物包括生物素、地高辛或荧光染料。

9.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述杂交缓冲液包括重组酶和PBS缓冲液，所述杂交缓冲液pH值为7.5，温度为40±2℃。

10.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述结合物包括链霉亲和素、抗地高辛或荧光染料的抗体；呈色剂包括胶乳或胶体金。