[发明专利]一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法

说明书

本发明公开了一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，包括以下步骤：S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证；S2、构建同源臂供体质粒，并获得定点整合转基因细胞系；S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。本发明在供体质粒中引入gRNA靶点序列，利用细胞内转录gRNA诱导Cas9核酸酶切割靶基因同时，线性化供体质粒，大大简化试验步骤，节约人力，且有利于提高共转染效率。本发明定点整合所用载体较少，同源臂大小适中，更有利于获得转基因细胞系，将高效定点整合技术，高活力定点转基因细胞培育技术与体细胞克隆技术结合，有利于定点整合转基因动物高效制备，加快转基因动物新品种培育速度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，应用于制备定点整合外源DNA片段的转基因动物，适用于长片段多基因定点整合转基因动物新品种培育。

背景技术

转基因大动物的获得依赖于体细胞克隆技术(SCNT)，成功构建相关转基因细胞系是转基因大动物获得的关键步骤。传统转基因技术，如显微注射，转座子，病毒载体包被侵染等把目的基因插入基因组内的整合方式是随机的，这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利，因此急需开发高效的定点整合转基因技术，构建定点整合外源DNA的转基因细胞系，用于家畜新品种培育。

动物基因组定点整合转基因技术是指动物基因组靶位点产生DNA双链断裂(double-strand break,DSB)后，通过同源重组修复(homologous-directed repair,HDR)机制，微同源重组机制(MMEJ)及单链寡核苷酸(SSODN)介导的重组修复机制，将外源基因及其调控区整合特定靶位点，获得定点整合外源基因的转基因动物。

定点整合技术的效率主要取决于两个方面，一是靶位点产生双链断裂(DSB)的效率。二是断裂后的靶位点与携带同源臂及外源基因的供体质粒(donor plasmid)发生重组的效率。传统同源重组技术依赖自然DSB产生，利用供体同源重组模板和自然产生的DSB，重组效率仅10-5e～10-7e，为科研和生产带来了极大的困难。有研究报道为矫正小鼠β-globin基因突变，需要提供8kb～24kb以上的同源序列，才能发生低频重组(0.48％～2.05％)。同源序列过长会增加供体质粒构建难度同时导致较低的转染效率，传统的同源重组技术成功率极低。

随着基因编辑技术突飞猛进，如ZFN、Talen和CRISPR/Cas9等，在基因组特定位点高效获得DSB已不再是同源重组的限制性条件。如在斑马鱼中研究显示，利用Talen技术，借助238bp～1168bp的左臂和673bp～3716bp的右臂，可轻松实现小片段2A-GFP基因(约700bp)定点插入Sox2基因下游，整合效率10～90％。2015年，Byrne等使用CRISPR/Cas9系统将人内源hTHY1基因(2.7kb)置换为鼠源mTHY1(2.5kb)时，发现置换效率与同源臂长度和同源臂长度比例有关，当右臂不变时(R2466bp)，置换效率随左臂长度增加而升高(L100～800bp)，但L821与L1550效率接近(17.8％Vs 16.8％)，均高于L4573bp和R4803bp组(10.1％)。Kung等(2013)研究显示，将1.1kb外源片段整合到叶缘焦枯病菌(Xylellafastidiosa)时，同源臂在96～1000bp范围内，HR效率呈指数上升，但同源臂在1kb～4kb范围，其重组效率不在增加，而是出现平台期。置换效率还有切割位置有关，位于左侧gRNA切割的置换效率高于右测。

定点整合效率与整合片段的长度存在正比例的线性关系，片段越大，其重组率越低。Kung等(2013)研究显示，将1.1kb的片段整合到叶缘焦枯病菌的基因组，同源臂1kb时最高，其HR效率为5.62×10^-5；但若采用1.1bp同源臂整合的片段长度达到6kb，就检测不到重组的发生。获得整合相同位点的不同家系的转基因动物是转基因新品种培育的基础，但受限于长片段较低的整合效率，转基因新品种培育难度很大。