[发明专利]一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种稳定共表达鸡源BCRP和P‑gp转运体的MDCK细胞模型及其构建方法与应用。该细胞模型的名称为MDCK‑chBCRP/P‑gp；制备方法为分别构建含鸡BCRP和鸡P‑gp慢病毒的表达载体，然后分别转染293T细胞得到含鸡BCRP和鸡P‑gp的慢病毒，再依次感染MDCK细胞，依次经含1μg/mL的嘌呤霉素和1200µg/ml新霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP和鸡P‑gp转运体的MDCK细胞模型。本发明的细胞模型可用于鸡BCRP和鸡P‑gp对其共同底物转运规律的研究，在禽类药物开发上有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK 细胞模型及其构建方法与应用。

背景技术

自从组合化学问世以来，候选化合物的合成速度大大加快，如何在新药开发早期阶段就对候选化合物进行体外药动学的高通量筛选，并结合体外筛选结果尽早作出综合评价，已成为目前创新药物研究的主导趋势。而药物在转运蛋白层面的相互作用已被认为是引起代谢性药物相互作用的重要原因之一，FDA最新指导原则指出所有药物必须进行药物转运蛋白的检测分析。

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC转运蛋白)是一类具有多种功能的膜蛋白超家族,其主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物转出质膜。根据ABC转运蛋白保守区序列的同源性，可将其分为7个亚型(ABCA～ABCG)，其中ABCB1(P-gp)和ABCG2(BCRP)是研究较多的两个成员，也是与药物外排密切相关的两个转运蛋白。P-gp和ABCG2共分布在具有分泌和排泄功能的组织中，比如小肠、肝脏、胎盘和血脑屏障上。P-gp和ABCG2可以单独或是同时有效地外排众多的外源物质，包括常用的兽药，这在维持机体稳态的同时也限制了众多口服药物的吸收。

细胞模型方法所需的药物量少、实验方法简单、药物分析迅速、温度、pH和环境条件可控，能够快速获得药物透膜的转运机制，达到体外高通量筛选的目的。但是原代细胞来源困难，不易培养，因此采用建立转基因细胞系的方法就成为研究药物与转运蛋白之间相互作用的重要方法。MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞系是以马丁达比犬肾上皮细胞为原型，演变得到的一种细胞间具有紧密连接，且自身内源性转运蛋白和代谢酶活性较低的细胞系。因MDCK细胞与小肠上皮细胞生理特性类似，而常用于体外药物吸收特性的研究，且MDCK 细胞培养周期较短，可以更快速的用于抑制剂的筛选及底物的鉴定。因此将ABC转运蛋白导入MDCK细胞系中，可建立一个理想的细胞模型。

但目前运用于药物开发中药动学筛选的转运蛋白高表达的细胞模型存在两个特点：一是转运蛋白集中在人源ABC家族上，二是大多为转运体单表达的细胞模型。而ABC家族蛋白存在一定的物种差异性，且一个氨基酸的变化就可能会引起底物和抑制剂的变化，因此有必要对不同物种进行专一的研究；而转运体单表达的细胞模型无法深入研究多个转运蛋白之间的相互作用。

发明内容

针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的 MDCK细胞模型及其构建方法与应用，该细胞模型可研究BCRP和P-gp共同底物在不同的浓度下与BCRP和P-gp的亲和力，更准确预测所研究的分子化合物在体内的代谢情况。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型，分别构建含鸡BCRP和鸡P-gp的慢病毒表达载体，然后分别转染293T细胞得到含鸡BCRP和鸡P-gp的慢病毒，再依次感染MDCK细胞，依次经含1μg/mL的嘌呤霉素和1200μg/ml新霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP和鸡P-gp转运体的MDCK细胞模型，即MDCK-chBCRP/P-gp。

上述稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型的构建方法，包括以下步骤：