[发明专利]一种荧光染料及其制备方法与在细菌检测中的应用

说明书

本发明涉及一种荧光染料及其制备方法与在细菌检测中的应用，本发明的荧光染料以高亲和力结合dsDNA的光反应性染料，自身的荧光非常微弱，但是结合核酸后荧光信号很强，这些染料是细胞膜不可渗透的，只能进入破损的细胞膜与DNA通过共价键结合从而导致永久的DNA修饰，这些被修饰过的DNA不能够再扩增，因此与PCR方法联合使用能够很好的弥补常规检测方法的不足。

技术领域

本发明属于染料化合物技术领域，具体涉及一种荧光染料及其制备方法与在细菌检测中的应用。

背景技术

常规细菌培养法是最常见的细菌检测方法。但是有些细菌处于特殊的存活状态中，即处于细菌活的非可培养状态（Viable but nonculturable state，VBNC），其特征是具有生物活性和致病性（即隐形传染源），但在常规条件下培养时，在培养基上不生长繁殖导致常规细菌培养法失去效力。对于这样状态细菌的检测，在食品检疫、水质检测与疾病预防与控制等领域显得尤其重要。比如食源性病原菌一旦进入VBNC状态常会造成漏检，从而引起严重的公共卫生危机，甚至会发生传染病的爆发。为了检测到处于活的非可培养状态的细菌的方法有很多种，其中一种是基于核酸（DNA）分子的VBNC细菌PCR 检测方法。该方法具备很大的优点，因为VBNC细菌基因组DNA易提取，PCR技术又非常快速、灵敏、特异，并且操作简便。但在实际应用中，该法一个最大的缺憾便是难以排除假阳性的干扰。因为在对基因组DNA的提取时，如果无法对死细菌和活细菌进行区分时，死细菌中的DNA有时会依然具备扩增性，死细菌中DNA的提取无疑会对后续PCR的结果产生假阳性。

细菌活的非可培养状态是在1982年提出的。VBNC 状态的细菌不再分裂增殖但保持其活性，即仍具有潜在致病性以及代谢活性和基因表达等生物学特性。作为活细菌，具备如下特征：其胞膜完整，而细胞壁结构发生改变；具有代谢活性(如呼吸运动、吸收生化物质等)或者能合成DNA、存在mRNA 分子以及VBNC 特异性基因。因此以检测核酸为基础的检测方法是检测VNBC细菌的重要手段之一。在这些方法里面，以mRNA分子为基础的检测技术具备假阳性低的特点，然而由于mRNA分子丰度偏低且不稳定，因此导致敏感性与特异性均很低。以检测DNA为基础的方法即基于DNA分子的VBNC细菌PCR检测法特异性较高且简便省时。但由于DNA分子比较稳定，即使细菌裂解甚至死亡之后DNA仍然可以长期保留而不发生降解，常规的PCR法无法区分细菌的死活状态，死细胞或者自由的DNA也能被当作目的基因被检测出来，但其已经失去致病能力，这样检测的假阳性率非常高，因此需要建立一种新的检测方法弥补这种不足。

为了弥补基于DNA分子的VBNC细菌PCR检测法的不足，有一类染料被应用在这个检测方法上以消除可能带来的假阳性；比如溴化乙锭（EMA）、叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)、PMAxx染料以及PEMAX染料等等。针对于上述几种染料，已经有很多研究性文章进行了研究。研究显示针对受热致死细菌，如果温度不够高，此时导致细胞膜的损失不足，那么EMA和PMA均无法进入细胞里面，实验证明需在60℃或更高温度才能使得细菌发生明显的膜损伤水平，此种情况下EMA比PMA更有效地穿透热损伤的细胞；但是EMA同PMA相比也有很大的缺陷，比如，不仅EMA对活细胞膜的渗透性远大于PMA，导致活细胞的基因组DNA显著损失；然而，一些研究也发现，PMA-PCR方法在去除死细胞信号方面不能完全有效；Kralik等人报道使用分枝杆菌的膜可渗透细胞可以获得不超过2 log的PCR信号；Pan和Breidt也表明PMA-PCR并不总是能消除热杀死的单核细胞增生利斯特氏菌的信号；EMA-PCR也有类似的问题，即对死细胞信号的不能完全抑制；Biotium. Inc.研发的PMAxx是一种新的和改进的可行性PCR染料，功能与PMA非常相似，具有更大的活性和区分活细菌和死细菌的能力，但是同时对于细胞的毒性也更大。这种染料在消除死细胞DNA的PCR扩增方面更有效，但是很多时候需要同Biotium Inc.提供的一种增强缓冲液一起使用，比如当通过PCR扩增来自革兰氏阴性细菌的序列时，用染料和增强缓冲液预处理的样品显示来自死细胞的信号降低，而来自活细胞的信号没有变化，但是这种增强缓冲液对于使用温和方法如低热灭菌细菌的样品是必须的。