[发明专利]一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物，其特征在于，在微生物菌株基因组中长度为313bp的nif启动子区替换为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述微生物为多粘类芽孢杆菌。

2.权利要求1所述的耐铵固氮微生物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用引物MPnif1和MPnif2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1205bp的上游同源臂；

利用引物MPnif5和MPnif6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1101bp的下游同源臂；

利用引物MPnif3和MPnif4，以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板PCR扩增得到长313 bp的GlnR第二个结合位点发生突变的nif启动子区；

用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；

（2）用BamHI和HindIII酶切温敏型质粒pRN5101，得到酶切片段；

（3）用Gibson assembly master mix将回收纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体pRMP2，其中Gibson assembly master mix为New England Biolabs品牌；

（4）将载体pRMP2通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的nif启动子区第二个GlnR结合位点突变的菌株MPnif；

其中，所述引物MPnif1、MPnif2、MPnif3、MPnif4、MPnif5和MPnif6的核苷酸序列如SEQID NO.2~7所示。

3.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在提高多粘类芽孢杆菌微生物在高铵条件下固氮酶活性方面的应用，其特征在于，通过使所述微生物基因组DNA中的nif启动子区第二个GlnR结合位点发生突变，提高多粘类芽孢杆菌微生物在高铵条件下固氮酶活性；所述高铵条件指微生物所处环境中NH₄⁺的浓度为100mM。