[发明专利]酮还原酶、核酸、重组表达载体、重组表达菌株及应用

说明书

本发明提供了提供了一种酮还原酶，编码所述酮还原酶的核酸，包含所述核酸的重组表达载体，包含所述重组表达载体的重组表达菌株及其制备方法，以及所述酮还原酶在不对称还原制备(S)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶中的应用。相对于现有的其它制备方法，使用本发明的述酮还原酶所制备的(S)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶不仅浓度和光学纯度高，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，特别是涉及一种酮还原酶、核酸、重组表达载体、重组表达菌株及酮还原酶在不对称合成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用。

背景技术

(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是一种重要的医药中间体，在镇痛，抗精神病、抗肿瘤等药物中广泛应用，如依鲁替尼。

(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶可通过化学或者拆分获得，但是化学法或者拆分法的局限在于收率比较低，拆分法理论上最高收率50％。

在生物学上，手性羟基化合物可通过酶催化合成，其反应条件温和，能够使产物对应选择性达到99％。目前，越来越多的药物或者中间体是通过生物催化的方式来合成的。生物催化法是通过对前体N-Boc-3-哌啶酮不对称还原成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。

专利CN201310173088.2公开了一种利用重组酮还原酶(KRED)酶粉来不对称还原N-Boc-3-哌啶酮，但是并没有公开酮还原酶(KRED)的基因序列或者氨基酸序列。专利CN201310054684.9公开了一种利用醇脱氢酶PAR来不对称合成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，但是利用了有机试剂异丙醇来进行辅酶循环，有机试剂对酶活力有较大程度的损害，且有明显的抑制作用。专利CN201610132936.9公开了一种利用羰基还原酶ReCR酶液体来不对称还原酮还原酶(KRED)，但是该酶液需要经过Ni-NTA纯化，且是用仲辛醇-水两相反应，不利于放大生产或生产成本比较高。

发明内容

针对已报道的不对称还原反应制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶反应中收率低、反应条件不友善、以及成本比较高的问题，本发明的目的在于提供一种催化活性高、对映选择性强、收率比较高的酮还原酶，还提供了编码该酮还原酶的核酸，含有该核酸的重组表达载体、包含所述重组表达载体的重组表达菌株及其制备方法，以及该酮还原酶在不对称合成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种酮还原酶，是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)在(a)所述多肽的基础上经过突变、缺失或添加一个或几个氨基酸的具有酮还原酶性质的多肽；所述突变是在所述多肽的基础上进行1-10个氨基酸的突变，即经过突变后的多肽仍然具有酮还原酶的性质，几个是指在1-30个的氨基酸，比如增加His Tag标签或添加一段分泌表达的信号肽；

(c)与(a)所述多肽具有至少90％同一性且具有酮还原酶活性的多肽。

一种编码本发明所述酮还原酶的核酸。

一种包含本发明所述核酸的重组表达载体。

一种包含本发明所述重组表达载体的重组表达菌株。

本发明所述重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：

(a)将所述重组表达载体转化到宿主细胞，涂布在含有50μg/mL氨苄的LB平板上，37℃过夜培养后，从中挑选阳性菌落接种到50mL液体LB培养基中进行培养；培养4h后，吸取10ml种子液转入1L新鲜的LB液体培养基；