[发明专利]木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用

说明书

本发明涉及具有提高的催化活性的木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、含有该DNA分子的重组菌株及它们的应用。通过对天然木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的木糖异构酶突变体，并且所获得的木糖异构酶突变体具有较高的热稳定性；进而，通过合成生物学方法构建的含有该木糖异构酶突变体的重组酵母可有效应用于C5糖和C6糖共发酵产乙醇，发酵效率和乙醇产率得以显著提高。因此，本发明的木糖异构酶突变体及重组菌株在化工、能源、食品、医药等领域具有广泛应用价值，可高效地进行糖‑醇转化发酵。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程和基因工程领域。具体而言，本发明涉及具有提高的催化活性的木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用。

背景技术

木糖异构酶(Xylose isomerase，XI；EC 5.3.1.5)能够催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，在微生物体内的糖代谢过程中起着重要作用，也具有极其广阔的工业应用价值。特别地，在天然微生物中，存在两种将木糖代谢为木酮糖的途径，包括经由木糖异构酶的途径以及经由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的途径。在细菌(如密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli))、少数真菌(如梨囊鞭菌属(Piromyces)和根囊鞭菌属(Orpinomyces))以及植物(如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)和水稻(Oryza sativa))等中，通过木糖异构酶的作用，仅需一步反应即可将木糖直接异构化为木酮糖。

在纤维素乙醇菌株开发中，菌株对木糖的利用及转化为乙醇的能力是最为关键的。利用木糖异构酶构建发酵半纤维素水解产物木糖来生产乙醇的重组菌株成为研究热点。就此而言，一方面，迄今为止在酵母、特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中能够表达出的具有活性的木糖异构酶较少；另一方面，在木糖代谢途径中，木糖异构酶为关键限速酶，直接影响木糖在酵母中的代谢速度。因此，新型木糖异构酶的开发和分子改造尤为重要。源于真菌及嗜热细菌的木糖异构酶能够在酵母中表达并显示出活性，并参与酵母木糖代谢途径的构建。基于木糖异构酶特定的催化机理进行理性设计并提高其催化效率，对构建新型高效利用木糖的重组酵母而言具有重要的应用意义和价值。

然而，如何有效地得到具有提高的催化活性的木糖异构酶并将其在工业生产中加以应用，在本领域中仍罕有报道，不能满足实际需求。

发明内容

本发明的发明人通过研究发现，通过对天然木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的木糖异构酶突变体，并且所获得的木糖异构酶突变体具有较高的热稳定性；进而，通过合成生物学方法构建的含有该木糖异构酶突变体的重组酵母可有效应用于C5糖和C6糖共发酵产乙醇，发酵效率和乙醇产率得以显著提高。

因此，根据第一方面，本发明提供了木糖异构酶突变体，其中，所述木糖异构酶突变体在天然木糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID No.13)中引入了如下突变中的一种或多种：Ala144Thr、Asn145Asp、Lys415Ala、Asn145Asp/Lys415Ala、Gly307Lys以及Gly307Arg。在一些优选实施方式中，所述木糖异构酶突变体具有选自于如下氨基酸序列中任一者的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5以及SEQ IDNo.6。

根据第二方面，本发明提供了编码如第一方面所述的木糖异构酶突变体的DNA分子。在一些优选实施方式中，所述DNA分子具有选自于如下核苷酸序列中任一者的核苷酸序列：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11以及SEQ IDNo.12。