[发明专利]一组鉴定鳖甲的特异性引物及其鉴定方法

说明书

本发明涉及一组鉴定鳖甲的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域；本发明首先制备DNA供试品溶液，并以此样品为模板，选用经设计、筛选得到的特异性核苷酸序列为引物进行PCR扩增，继而将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析与凝胶成像系统检测，最终依据检测结果对鳖甲产品的真伪、掺伪情况进行判断；通过本发明中的方法，可以判断样品中是否掺伪；本方法操作简便、无需测序、专属性强、抗干扰能力强、重复性好，而且适用范围广，可用于鳖甲基原、药材和饮片的准确鉴定，为判别鳖甲产品的真伪及掺伪情况提供了切实可行的方法。

技术领域

本发明涉及一组鉴定鳖甲的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域。

背景技术

鳖甲(Trionycis Carapax)，为鳖科动物鳖(Pelodiscus sinensis)的背甲，是一种传统中药，始记载于《神农本草经》，被列为中品。历代本草均有记载，现被国家卫生局列为药食两用类中药。鳖甲性微寒，味咸，归肝、肾经，能滋阴潜阳，退热除蒸，软坚散结。主治阴虚发热，骨蒸劳热，阴虚阳亢，头晕目眩，虚风内动，手足瘈疭，经闭，癥瘕，久疟疟母等。

鳖甲为临床常用中药，由于同名异物、民间用药差异、亲缘物种的纹路、颜色等形态学特征相似以及专业经验的缺乏等因素，常有鳖甲伪品和掺伪品混入市场，如佛罗里达鳖，其繁殖力强，生长周期短，产量高，但营养价值和食疗价值低于鳖，药效主治不明确。对用药的安全性和有效性均带来不良影响。目前，鳖甲的鉴别仍然主要依靠传统的性状鉴别技术，即从外观、色泽、质地、气味等方面来评价，其经验依赖性强、准确性较低。此外，部分产品在经过一系列的加工处理后，难以应用形态学考察等常规方法进行有效鉴别。

由于DNA存在于大多数生物组织中且非常稳定，检测用量少，因此可以选择鳖甲特有的DNA片段作为用于专属性鉴定的识别物。在运用分子标记技术鉴定鳖甲的研究中，现有的技术仅能够应用于鳖甲药材及基原样品，尚无法鉴别饮片及掺伪品，应用范围较为局限。此外，也有研究人员利用基于COI序列的DNA条形码技术对鳖及常见混伪品进行分子鉴定，该方法亦仅用于药材及基原，且荧光干扰、碱基错配、生物进化速率等因素使得种内变异阈值难以确定，检验结果的准确性存疑。此外，还有步骤繁琐、时间和成本高等固有缺陷。

PCR具有特异性好、灵敏度高(指数增加)、重复性好、操作简便、高通量(每台仪器单次可扩增96个样品)等优势；然而，在常规PCR技术利用DNA序列进行物种的鉴定过程中，由于采用了COI、ITS等区域的通用引物，因此在完成扩增后，需要进行产物测序并与基因数据库比对，然后才能判断种属，步骤较多、耗时长、需要专门设备；此外，还无法实现对于掺伪品的检识，或者由于掺伪现象而影响鉴定结果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，建立较为完善的鳖甲鉴定体系，即基原、药材、饮片。

本发明针对鳖甲正品以及常见伪品的基原分别设计了特异性引物，并提供了利用特异性引物组扩增技术鉴别鳖甲的方法。该法操作简单、专属性强、鉴别快速、无需测序，能准确、直观地鉴别鳖甲的真伪(包括掺伪)。本发明为鳖甲的专属性鉴定提供一条新的途径，有助于监控鳖甲产品的质量，从而有利于保障临床用药的安全性、有效性，具有重要的应用价值。

本发明通过以下步骤达到鉴定鳖甲系列产品的目的：

本发明首先提供一组用于鉴定鳖甲的特异性引物，所述引物为PPS-1或PPS-2，具体如下所示：

PPS-1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示，分别为：

PPS-1-F(SEQ.ID.NO.1)：AGCCCTATCAGTTTGAATACCAC

PPS-1-R(SEQ.ID.NO.2)：CAACCGGACCATATAATTGAGT

PPS-2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示，分别为：