[发明专利]一组鉴定龟甲的特异性引物及其鉴定方法

说明书

本发明涉及一组鉴定龟甲的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域；本发明首先将龟甲产品粉碎后提取与纯化基因组DNA，并以此样品为模板，选用经设计、筛选得到的特异性核苷酸序列为引物进行PCR扩增，继而将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析与凝胶成像系统检测，最终依据检测结果对龟甲产品的真伪、掺伪情况进行判断；通过本发明中的鉴定方法，可以判断样品中是否混有伪品；本方法操作简便、无需测序、专属性强、抗干扰能力强、重复性好，而且适用范围广，可用于龟甲基原、药材和饮片的准确鉴定，为判别龟甲产品的真伪及掺伪情况提供了切实可行的方法。

技术领域

本发明涉及一组鉴定龟甲的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域。

背景技术

龟甲(Testudinis Carapax ET Plastrum)，为龟科动物乌龟(Chinemysreevesii)的背甲及腹甲，是一种传统的动物类中药，其始记载于《神农本草经》，被列为上品。历代本草均有记载，现被国家卫生局列为药食两用类中药。龟甲性微寒，味咸甘，归肝、肾、心经，能滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固经止崩等，主治阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目眩、虚风内动、筋骨痿软、心虚健忘、崩漏经多等。

龟甲为临床常用中药，其基原乌龟养殖困难且生长期较长，一般最少5～6年方可供药用，导致国内药材资源不足。此外，同名异物、民间用药差异、亲缘物种的纹路、颜色等形态学特征相似以及专业经验的缺乏等因素，常有龟甲伪品和掺伪品混入市场，如巴西龟、花龟，对用药的安全性和有效性均带来不良影响。目前，龟甲的鉴别仍然主要依靠传统的性状鉴别技术，即从外观、色泽、质地、气味等方面来评价，其经验依赖性强、准确性较低。此外，部分产品在经过一系列的加工处理后，难以应用形态学考察等常规方法进行有效鉴别。

由于DNA存在于大多数生物组织中且非常稳定，检测用量少，因此可以选择龟甲特有的DNA片段作为用于专属性鉴定的识别物。在运用分子标记技术鉴定龟甲的研究中，有研究人员设计一对专用于乌龟的鉴别引物，用于龟甲药材及原动物的鉴定。也有研究人员针对Cyt B和COI序列，设计2对特异性引物，建立复合PCR技术对龟甲药材进行真伪鉴别；然而，该技术仅可应用于龟甲药材及基原样品，尚无法鉴别饮片及掺伪品，应用范围较为局限。此外，利用基于COI序列的DNA条形码技术对乌龟及常见混伪品进行分子鉴定，该方法亦仅用于药材及基原，且荧光干扰、碱基错配、生物进化速率等因素使得种内变异阈值难以确定，检验结果的准确性存疑。此外，还有步骤繁琐、时间和成本高等固有缺陷。

PCR具有特异性好、灵敏度高(指数增加)、重复性好、操作简便、高通量(每台仪器单次可扩增96个样品)等优势；然而，在常规PCR技术利用DNA序列进行物种的鉴定过程中，由于采用了COI、ITS等区域的通用引物，因此在完成扩增后，需要进行产物测序并与基因数据库比对，然后才能判断种属，步骤较多、耗时长、需要专门设备；此外，还无法实现对于掺伪品的检识，或者由于掺伪现象而影响鉴定结果。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的问题，建立较为完善的龟甲鉴定体系，即基原、药材、饮片。

本发明针对龟甲正品以及常见伪品的基原分别设计了特异性引物，并提供了利用特异性引物扩增技术鉴别龟甲的方法。该法无需测序，操作简单、专属性强、耗时短，能准确、直观地鉴别龟甲的真伪(包括掺伪)。本发明为龟甲的专属性鉴定提供一条新的途径，有助于监控龟甲产品的质量，从而有利于保障临床用药的安全性、有效性，具有重要的应用价值。

本发明通过以下步骤达到快速检测龟甲系列产品的目的：

本发明首先提供一组用于鉴定龟甲的特异性引物，所述引物为PCR-1或PCR-2或PCR-3，PCR-1的上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示；PCR-2的上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示；PCR-3的上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示。