[发明专利]用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物对、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物对，其特征在于，包括针对Reprimo基因与RNF180基因的启动子区以及β-Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：

Reprimo正向引物：5'-TGCGAGTGAGCGTTTAGTTC-3'，

Reprimo反向引物：5'-TCCGTCTAATTACCTAAAACCGA-3'，

Reprimo检测探针：5'-AACGAACGAACGCCGCGAACGAC-3'；

RNF180正向引物：5'-TGCGGGGTTTGGTTTTTGT-3'，

RNF180反向引物：5'-AAAACCTCCAACTTCACACCC-3'，

RNF180检测探针：5'-CGTCGTCGGAGTCGTAGCGAGTTT-3'；

其中，所述Reprimo检测探针及RNF180检测探针的5'端分别使用FAM，VIC标记作为发光基团，3'端均使用BHQ1作为淬灭基团；

β-Actin正向引物：5'-ATTTGAGATGTATGAAGGTTTTTGG-3'，

β-Actin反向引物：5'-ACACCACAAAATCACACTTAACCT-3'，

β-Actin检测探针：5'-AAACCCTAACTACCTCCACCCACTCCCA-3'；

其中，所述β-Actin检测探针的5'端使用ROX标记作为发光基团，3'端使用BHQ2作为淬灭基团。

2.一种用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液包括：Reprimo正向引物、Reprimo反向引物及Reprimo检测探针，RNF180正向引物、RNF180反向引物及RNF180检测探针，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物及β-Actin检测探针，10×PCR buffer，dNTP、Mg²⁺及无核酸酶水。

3.根据权利要求2所述的用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Ex Taq酶。

4.根据权利要求2所述的用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCR buffer，0.4μM Reprimo正向引物、0.4μM Reprimo反向引物、0.2μM Reprimo检测探针，0.4μM RNF180正向引物、0.4μM RNF180反向引物、0.2μM RNF180检测探针，0.4μM β-Actin正向引物、0.4μM β-Actin反向引物、0.2μM β-Actin检测探针，4.0mM dNTP，4.0mM Mg²⁺。

5.根据权利要求2-4中任一所述的用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品及阴性对照品，所述阳性对照品分别为Reprimo甲基化标准品DNA及RNF180甲基化标准品DNA，所述阴性对照品为非甲基化标准品DNA。

6.一种用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提的DNA，对其进行转化处理，转化后的DNA作为PCR的模板；

步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，对所述模板进行PCR扩增；

步骤三：结果分析，检测结果满足质控要求，即待检测样本β-actin的检测Ct值≤33时根据检测结果对样本进行判断；根据样本检测结果Reprimo基因Ct值与Reprimo预先设定Ct值的差别，判断待检测样本Reprimo基因甲基化检测是否为阳性；根据样本检测结果RNF180基因Ct值与RNF180预先设定Ct值的差别，判断样本RNF180基因甲基化检测是否为阳性。

7.根据权利要求6所述的用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的方法，其特征在于，所述步骤一中转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。

8.根据权利要求7所述的用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的方法，其特征在于，所述步骤二中PCR扩增反应程序为：50℃ 2min；95℃变性5min；45cycles，95℃ 15sec，55℃ 45sec。