[发明专利]金黄色葡萄球菌干粉化LAMP快速检测试剂盒

说明书

本发明公开了金黄色葡萄球菌干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液组成，以上7种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的6条引物对应金黄色葡萄球菌特异性基因序列的8个区段，反应体系加入显色液，反应结束后阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全卫生领域中金黄色葡萄球菌的快速检测。另外，本发明为干粉化的检测试剂，可适应高温运输，且使用简单、快捷，无需昂贵仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对金黄色葡萄球菌的快速检测，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化金黄色葡萄球菌核酸快速检测试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus,SA)，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，能产生毒素，对肠道破坏性大，所以金黄色葡萄球菌肠炎易引起病急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生，在细菌性食物中毒事件中仅次于副溶血性弧菌和变形杆菌，并被列为我国食品卫生微生物常规检测项目之一，因此食品卫生中对金黄色葡萄球菌的防控尤为重要。

在检测手段上，目前国内外检测机构仍然主要采用传统的微生物学检验方法对金黄色葡萄球菌进行检测，整个过程一般需要3～5天，且操作过程繁琐，随着致病微生物规模化检测的需求不断增大以及快速准确检测的现实需求，传统的检测方法已经不能完全满足规模化检测需求，因此迫切需要建立新的快速检测技术和方法。金黄色葡萄球菌检验的传统检验方法主要为Baird-parker平板涂布法、为提高检测效率，也可用纸片法、酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增技术等分子生物学检测方法，进行快速检测和结果初筛。这些技术试图突破传统的形态学、生化反应等传统模式，不需要对目标菌进行分离提纯，而直接用样品或者样品的增菌液检测，使得检测向准确、快速和低成本方向发展。另一方面，这些快速方法也有其天然的缺陷，普通的PCR检测需要专门的仪器，检测过程相对繁琐，样品容易污染出现假阳性的情况，这使得其应用受到了限制。Real-time PCR需要更为昂贵的检测仪器，并且成本比较高。免疫学的检测方法依赖高质量的单克隆抗体，否则无法提供准确的结果。

LAMP技术是2000年由日本研究人员Notomi等开发的一种新型的体外恒温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。LAMP用于快速检测无需复杂仪器，具有操作便捷、灵敏度高、特异性好、判读简单、检测范围广以及成本低的优点。在常规操作中，检测前均要配制对应的溶液反应体系，其中组分较多，频繁操作极易导致试剂污染、检测区间污染以及结果误差等，加之该反应体系中部分试剂需要冷冻储存，如Bst DNA聚合酶需在-20℃条件下储存，温度过高会影响其酶活性，造成检测试剂失活。因此对高温下冷链运输以及现场应用提高了要求，也提高了相应成本。同时，作为非标方法尚未在食品安全、医疗卫生等领域推广开来，而且目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式方法均无提及。且市场上基于环介导恒温扩增技术的金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。

发明内容

本发明的目的在于针对现有金黄色葡萄球菌检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒以及其制备方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足食品安全生产和流通各个环节的快速检测的需求。

本发明所采取的技术方案是：

一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：