[发明专利]芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法

说明书

本发明提供了一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。所述提取方法包括：使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解；所述酶解液由酶液与SCW液组成，所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、甘露醇和CaCl₂，pH为5.6；所述SCW液包括山梨醇、CaCl₂和MES，所述SCW液的pH为5.8；向酶解产物中的上清液中加入W5溶液，离心取沉淀，向所述沉淀中加入含有MES的蔗糖溶液，离心取原生质体沉淀，再向其中加入W5溶液，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。本发明克服了提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的缺点，并且该方法融合效率比较高，原生质体仍能保持较高的细胞活性。

技术领域

本发明涉及十字花科蔬菜育种技术领域，更具体地，涉及一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。

背景技术

细胞质雄性不育是十字花科蔬菜杂种优势利用的主要途径。通常是利用不同来源的细胞质雄性不育源，通过杂交和多代回交，选育不育性稳定地细胞质雄性不育系为骨干材料，配制出综合性状优良的杂种一代。通过细胞质雄性不育系进行优势育种，克服了以往十字花科蔬菜采用自交不亲和系所带来的不亲和性难于保持、自交多代易发生双亲生活力衰退以及容易出现假杂种等弊端，但是往往由于核质互作不配套导致的后代植株表型上的不足，不能满足杂种一代的经济性状的要求，引起制种产量低，不利于芥菜新品种的推广。因此，探究利用新的技术手段(如细胞工程和生物技术)改良芥菜不良性状，有重要的理论和育种实践意义。

芥菜起源于中国，由于芥菜花器官小，是常自花授粉作物，自交亲和性好，因此细胞质雄性不育系是芥菜杂种优势利用的主要途径。芥菜hau CMS是华中农业大学1999年发现的一种新的细胞质雄性不育类型，通过对芥菜hau CMS的不育性评价、线粒体不育基因的分子鉴定、不育基因克隆、转基因功能验证及线粒体基因组测序，明确了芥菜hau CMS是一种十字花科作物胞质不育新类型。本发明所采用的芥菜细胞质雄性不育系FanY-9A材料，是通过芥菜型油菜hau CMS与分蘖芥菜(雪里蕻)自交系杂交和回交，选育获得分蘖芥菜(雪里蕻)hau胞质雄性不育系。但是该杂交后代存在种荚弯曲畸形，不直立，导致后代结籽率不高，制种产量偏低。

细胞融合是一种细胞工程技术，是一种细胞水平上对作物进行遗传改良的手段，是对传统育种技术的一种提升，可用于改良原有材料或创制新的种质材料。细胞融合技术将2个不同的材料进行细胞质和细胞核融合，可极大程度地缩短育种周期，增加杂种后代的多样性，育种工作者可以筛选大量高质量的原生质体获得期望的优良表型，但是提高细胞融合效率一直是该技术的关键问题。

发明内容

为了解决目前芥菜原生质体提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的问题，本发明的第一目的在于提供了一种芥菜原生质体的提取方法。

该提取方法包括如下步骤：

1)使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解，得到芥菜粗原生质体液；所述酶解液由体积比为3:(5-10)的酶液与SCW液组成，所述酶液包括0.3％-1.0％纤维素酶、0.05％-0.2％果胶酶、0.1M-0.5M甘露醇和70mM-80mM CaCl₂；所述SCW液包括0.3M-0.8M山梨醇、8mM-15mM CaCl₂和2mM-10mM MES；

2)向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入W5溶液，离心后向沉淀中加入W5溶液重悬后加入到含有MES的蔗糖溶液中，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。

其中，步骤1)中所述酶液包括0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、0.2M甘露醇和80mMCaCl₂，所述酶液的pH为5.6；所述SCW液包括0.5M山梨醇、10mM CaCl₂和5mM MES，所述SCW液的pH为5.8。

在一个优选实施方式中，酶液与SCW液的体积比为3:7。