[发明专利]用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒

权利要求书

1.用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的引物组合，所述引物组合为引物组I、引物组II、和/或引物组III；

所述引物组I由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198A和Tub-BIP组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；

所述引物组II由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198V和Tub-BIP组成，所述Tub-FIP-E198V的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述引物组III由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198K和Tub-BIP组成，所述Tub-FIP-E198K的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgSO4溶液和甜菜碱溶液。

4.权利要求1所述的引物组合或权利要求2或3所述的试剂盒在检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测灰葡萄孢的基因组DNA；

2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增；

3)分析步骤2)得到的扩增产物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中环介导等温扩增的反应总体积为25μL，反应体系为：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4溶液，1mM dNTPs，所述内引物各为1.2mM，所述外引物各为0.4mM，0.8M甜菜碱和1μL所述基因组DNA。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤2)中环介导等温扩增的条件为：63℃60min，85℃10min。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的应用，其特征在于，步骤1)中使用10×TE裂解液提取待测灰葡萄孢的基因组DNA。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的应用，其特征在于，步骤3)具体为：

向步骤2)得到的扩增产物中加入SYBR Green I染料后观察颜色反应；

或，对步骤2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

10.根据权利要求4至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用适用于田间检测。