[发明专利]一种纯化蛋白的方法

权利要求书

1.一种纯化蛋白的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:

1)选择S100A1蛋白构建待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体；

2)所述重组融合蛋白的表达:得到表达菌体；

3)所述重组融合蛋白的分离纯化:收集所述表达菌体，破碎所述表达菌体的细胞，离心并收集含所述重组融合蛋白的上清液,所述上清液进行阴离子交换柱初步分离,经过上样、洗脱并收集混合在300至400毫升范围内的洗脱液样品,向所述洗脱液样品中加入氯化钙(CaCl₂),上疏水层析柱，得到所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白；

4)电泳鉴定；

5)酶切纯化所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:满足下列中的一项或几项：

所述步骤1)中选择载体pET32a构建所述待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体，所述载体含有NdeI和HindIII酶切识别位点，鉴定所述重组融合蛋白的重组融合基因序列,获得阳性的重组表达载体；和/或

所述步骤3)中，所述上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF(DEAE-sephrose FF)阴离子交换柱进行初步的分离,所述上样的缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为7.5，100毫摩尔/升氯化钠(NaCl)，所述洗脱的缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为7.5，1摩尔/升氯化钠(NaCl)；向所述样品中加入5毫摩尔/升氯化钙(CaCl₂),水系滤器过滤,过滤后的所述样品上疏水层析柱，加入所述上疏水层析柱的平衡缓冲液三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，所述上疏水层析柱的洗脱缓冲液是三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和乙二醇双-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)；和/或

所述步骤4)中所述电泳鉴定包括的步骤是电泳凝胶、点样、染色、脱色液脱色、所述脱色期间更换2至4次所述脱色液，得到脱色后的凝胶，最后将所述脱色后的凝胶浸泡于水中；和/或

所述步骤5)中所述酶切纯化所述融合蛋白的条件为:酶切体系为15至25毫摩尔/升磷酸缓冲液，pH为7至8,酶切温度为35至37摄氏度,酶切时间为15至17小时,以所述融合蛋白3至5毫克/U(mg/U)肠激酶(EK)为基准做加酶量。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中所述重组融合蛋白的表达是将所述阳性的重组表达载体转入BL21感受态细胞中，于含氨苄青霉素的液体LB培养基中培养过夜,得到所述表达菌体。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤3)的所述离心步骤中，用pH为7.5的25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和100毫摩尔/升氯化钠的缓冲液悬浮后，用超声破碎仪破碎所述表达菌体，得到细胞裂解液，所述细胞裂解液用15,000转/分钟(rpm)的转速离心30分钟。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中所述水系滤器过滤是指16摄氏度放置一小时后用0.22微米(um)孔径的水系滤器过滤，过滤后的所述样品上柱体积为20毫升疏水层析柱，所述上疏水层析柱的平衡缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为7.5，所述上疏水层析柱的洗脱缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH 7.5，10毫摩尔/升乙二醇双-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)，洗脱两个柱体积后出现单一的峰。

6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤4)中所述电泳鉴定包括的步骤是12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳凝胶，点样10ul，然后用考马斯亮蓝R250染色4小时，然后脱色液脱色4小时，期间更换3次脱色液，最后将脱色后的凝胶浸泡于水中。