[发明专利]一种利用胭脂红作为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法

说明书

本发明公开了一种利用胭脂红作为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法。本发明研究发现壳聚糖能与胭脂红结合形成离子缔合物，使共振散射强度显著增强，壳聚糖浓度在一定浓度范围内与△I呈良好线性关系，以此作为壳聚糖的定量基础，建立了利用胭脂红作为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法。本方法具有操作简便，快速，成本低，灵敏度高，回收率高、重现性好等优点适合在实际应用中推广使用。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及壳聚糖含量测定技术领域，更具体地，涉及一种以胭脂红为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法。

背景技术

壳聚糖，化学名称为聚葡萄糖胺(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是一种在自然界中广泛存在于昆虫壳，虾壳，螃蟹壳、软体动物的骨骼和某些藻类等的骨骼中的天然高分子物质。随着不断的研究，人们发现壳聚糖具有的生物功能性即抗肿瘤，抗凝血，抗菌、减肥降脂和增强免疫力等功能，使之在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用得到巨大发展，并且有较大部分已进入实用阶段或商品化阶段。因此，壳聚糖的准确定量显得十分重要，建立简便高效的方法测定壳聚糖含量有着重要的意义，这将进一步推进壳聚糖在各个领域的应用。

目前，壳聚糖分析研究及测定的方法主要有分光光度法、荧光分析法、电化学法、红外光谱法测、液相色谱法、气相色谱法等。如马卫兴等人利用分光光度法研究壳聚糖与水溶苯胺蓝的超分子反应条件，并建立分析方法。穆志英等人建立核固红荧光猝灭法测定壳聚糖含量，利用壳聚糖在pH＝3.8的醋酸-醋酸钠缓冲介质中，壳聚糖对核固红的荧光强度有明显的猝灭作用，且在一定浓度范围内,壳聚糖的质量浓度与荧光猝灭程度呈线性关系，据此建立了荧光猝灭法测定壳聚糖含量的新方法。商军和王蓓两人建立高效液相色谱法测定原料和复合预混料中的低聚壳聚糖含量。谭学才，麦智彬等人建立了以茜素红(AR)为电活性探针间接测定无电活性的壳聚糖(CTS)的新方法。以上所述方法目前已报道的分光光度法存在灵敏度低、测定样品时不专一的缺点，而液相色谱法、核磁共振、质谱法等，存在耗时长、成本相对较高等缺点。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种胭脂红为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法。本发明研究发现壳聚糖与胭脂红各自本身的共振散射强度较低，在一定条件下，壳聚糖能与胭脂红结合形成离子缔合物，使共振散射强度显著增强，并出现新的RRS光谱。壳聚糖浓度在一定范围内与△I呈线性关系。

本发明所涉及的一种利用胭脂红作为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，包括如下步骤：

一种利用胭脂红作为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)标准曲线的绘制：向10mL比色管中加入一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，依次分别加入甘氨酸-盐酸缓冲溶液、胭脂红溶液，混合均匀后定容，得到稀释后的成浓度梯度的壳聚糖待测溶液，水浴加热反应一段时间，冷却至室温，检测壳聚糖待测溶液的共振瑞利散射强度，具体以λex＝λem进行同步扫描，记录RRS光谱，并于366nm处分别测量离子缔合物的I和试剂空白的I₀，ΔI＝I-I₀，绘制标准曲线，进一步得线性方程。

2)10μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。

3)样品检测：向10mL比色管中，按先后顺序依次加入样品操作液0.8mL，pH3.0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液1.0mL，胭脂红溶液(1.0×10^-4mol/L)1.0mL，用水定容至10mL刻度线，混合均匀。60℃水浴10min，冷却至室温，检测共振瑞利散射强度，由线性方程计算出待测样品中壳聚糖的浓度。同时做加标回收试验。