[发明专利]靶向间皮素的C-型单域抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种靶向间皮素的高亲和力C‑型单域抗体及其制备方法与应用。本发明是以人抗体IgG恒定区CH2结构域的突变体m01s为骨架，构建多肽文库，再以间皮素为抗原筛选获得，该类抗体分子量较小，相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，用于治疗和诊断一些间皮素高表达的肿瘤(如卵巢腺癌)，甚至能够开发成口服药；其次，它的血浆半衰期可能达到10个小时；最后，可在原核表达系统进行表达，生产成本低、周期短。而由本发明从该类抗体中筛选出的F3针对间皮素高表达的卵巢腺癌细胞OVCAR‑3具有较好的抑制作用，应用前景好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体及其制备方法与应用。

背景技术

间皮素(mesothelin,MSLN)是近年来新发现的一种肿瘤分化抗原。其前体是糖磷脂酰基醇(GPI)锚定的、糖基化的细胞表面蛋白，可被furin蛋白酶水解为31kD的N-末端分泌型蛋白和40kD的C-末端蛋白，后者主要以膜结合的GPI锚定的形式存在，有限分布于正常间皮细胞及表面上皮细胞，故命名为间皮素。间皮素在正常组织中有限表达，某些肿瘤中高表达：如胰腺癌(100％病例)、卵巢腺癌(70％的病例)、肺腺癌(50％的病例)和恶性间皮瘤(100％的病例)等。间皮素诱导肿瘤发生的机制可能包括以下三个方面：第一，间皮素可以通过与粘蛋白MUC16(即CA125)相互作用而促进肿瘤细胞的腹膜种植和转移；第二，间皮素能通过NF-κB信号通路促进肿瘤细胞的存活和增殖；最后，间皮素的表达会增强肿瘤细胞对某些特定的药物(如：TNF-α、紫杉醇、铂-环磷酰胺复合物)的耐受能力(Tang Z,et al.,Anticancer Agents Med Chem.,2013)。

由此可见，间皮素是一个用于肿瘤治疗的理想靶标。目前，有几种针对抗间皮素的候选药物在进行临床试验，包括抗间皮素抗体偶联免疫毒素、高亲和力鼠/人嵌合抗间皮素抗体和抗间皮素抗体偶联药物以及针对间皮素的肿瘤疫苗、T细胞过继免疫治疗等。

在抗体的研究过程中，人们发现全长抗体的分子量较大(～150kD)，使它们的组织渗透性较差，也难以结合一些空间上有位阻效应的关键表位，从而影响活性。解决的策略之一是将全长抗体进行小型化，由此开发了一系列具有结合功能的抗体片段：如Fab(50-60kD)、单链抗体(scFv，20-30kD)、重链可变区抗体(VH，12-15kD)(单域抗体)等小型化抗体。这些抗体片段相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力。

然而，无论是Fab，scFv还是VH，由于它们都缺少Fc段，从而无法和Fc受体(比如neonatal Fc receptor，FcRn)等相结合。目前观点认为IgG在体内具有很长半衰期(一周到数周)的原因是IgG可以通过Fc段在酸性pH(pH 6.0)和FcRn结合，在中性pH(pH7.4)被释放(该结合称为pH依赖的结合)，从而完成其循环再生的过程。由于缺少这种结合，Fab、scFv和VH在体内的半衰期通常只有几分钟到几十分钟，这就限制了它们进一步的应用。因此需要继续研发分子量小，血浆半衰期长的骨架用于抗体库的构建和针对特异抗原的筛选。