[发明专利]水稻遗传工程不育系的制备方法

权利要求书

1.一种水稻遗传工程不育系的制备方法，其特征在，包括以下步骤：

A、DsRED基因表达盒的获得；

B、水稻基因表达盒的获得；

C、玉米致死基因ZMAA1的扩增；

D、玉米花粉特异性启动子Pg47的扩增；

E、各基因表达元件的连接。

2.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系的制备方法，其特征在，所述步骤A、DsRED基因表达盒的获得，进一步包括：

以含有DsRed基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入EcoRI和Kpn I位点，同时在下游引物引入的KpnI位点前面加入Afl2酶切位点。

3.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系的制备方法，其特征在，所述步骤B、水稻基因表达盒的获得，进一步包括：

提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整EAT1基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入Sma I和Sal I酶切位点，其扩增的水稻EAT1基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。

4.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系的制备方法，其特征在，所述步骤C、玉米致死基因ZMAA1的扩增，进一步包括：

以玉米基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行玉米致死基因ZMAA1的扩增，在上下游引物中引入Afl2酶切位点；其扩增的致死基因ZMAA1包含所有的外显子和内含子。

5.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系的制备方法，其特征在，所述步骤D、玉米花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：

以玉米基因组DNA为模板，以F4/R4为上下游引物进行花粉特异性启动pPG47扩增，在上下游引物中分别引入Kpn I和Sma I酶切位点。

6.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系的制备方法，其特征在，所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第一步，将DsRED基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上；

第二步，将完整的水稻EAT1基因引入第一步中已经引入DsRED基因表达元件的pCAMBIA1300载体上；

第三步，将玉米致死基因ZMAA1连入到已经连有DsRED基因表达元件和水稻EAT1基因的pCAMBIA1300双元载体上；

第四步，将玉米花粉特异性启动pPG47连接到前三步已经连接上DsRED基因表达元件、水稻EAT1基因和玉米致死基因ZMAA1的复合载体上。

7.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系的制备方法，其特征在，所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第三步，利用上下游都引入的Afl2酶切位点，将玉米致死基因ZMAA1通过单酶切位点连入到已经连有DsRED基因表达元件和水稻EAT1基因的pCAMBIA1300双元载体上。

8.一种水稻普通核不育EAT1突变体的利用方法，其特征在于，应用水稻EAT1基因表达盒构建如权利要求1～6中任一项所述方法制备的水稻不育系。

9.一种如权利要求1～6中任一项所述方法制备的水稻不育系。

10.一种如权利要求1～8中任一项所述方法在水稻遗传育种中的应用。