[发明专利]一种抗性愈伤组织的筛选方法

权利要求书

1.一种抗性愈伤组织的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm条件下冲洗3-5次，最后一次用含500mg/L Cef的无菌水静置1h。

2.根据权利要求1所述抗性愈伤组织的筛选方法，其特征在于，进一步包括：置于无菌滤纸上干燥30min，直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在。

3.根据权利要求1所述抗性愈伤组织的筛选方法，其特征在于，进一步包括：将愈伤组织转移至含Hyg 20-25mg/L和200-400mg/L Timentin的筛选培养基进行筛选抗性愈伤，28℃暗培养，15d筛选一次，共筛选两次。

4.一种抗性愈伤组织的分化方法，其特征在于，包括以下步骤：从筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有Hyg 20-25mg/L和200-400mg/LTimentin的分化培养基上，先暗培养7d，然后转至15h/d光照条件下培养，经过15d长出新的抗性愈伤并且出现绿点。

5.根据权利要求4所述抗性愈伤组织的分化方法，其特征在于，进一步包括：挑选乳黄色致密有绿点的抗性愈伤组织转接于新的分化培养基上，于25d后进一步分化出小苗。

6.根据权利要求4所述抗性愈伤组织的分化方法，其特征在于，进一步包括：定期在超净工作台通风干燥抗性愈伤，防止分化的抗性愈伤水化。

7.一种PCR抗性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

DNA提取：取2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μL 1.5XCTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；加入等体积的24∶1氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，持续10min；10000rpm离心10min；吸取400μL上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的95％乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心15min；弃上清，加入500μL 75％乙醇，颠倒漂洗，12000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μL ddH2O溶解DNA。

8.根据权利要求7所述PCR抗性检测方法，其特征在于，进一步包括：以Hyg基因设计引物序列：F1：5′-GGACTTCGGGGCAGTCCT-3′；R1：5′-CGATGTAGGAGGGCGTGG-3′为引物。

9.根据权利要求7所述PCR抗性检测方法，其特征在于，进一步包括：PCR反应程序和体系如下：程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s；72℃延伸1.5min；30个循环；72℃再延伸10min；16℃结束；反应在20μL体系中进行，其中包括：10×EasyTaq Buffer(+Mg²⁺)2μL，DNA模板1μL，2mM dNTPs 2μL，10μM/L的正向，反向引物各1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶1μL，ddH₂O补足至20μL。

10.一种如权利要求1～6中任一项方法制备的水稻愈伤组织。