[发明专利]用于检测结核杆菌的引物和探针、试剂盒和方法

权利要求书

1.用于检测结核杆菌的巢式荧光引物和探针，其特征在于，所述引物和探针用于特异性扩增结核分枝杆菌的MPB64基因，所述引物和探针的序列如下：

第一轮PCR引物：

MPB64引物F1：5’-ATCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3’(SEQ ID NO.1)；

MPB64引物R1:5’-CTCGCGAGTCTAGGCCAGCAT-3’(SEQ ID NO.2)；

第二轮PCR引物和探针：

MPB64引物F2：5’-GTGAACTGAGCAAGCAGACCG-3’(SEQ ID NO.3)；

MPB64引物R2：5’-GTTCTGATAATTCACCGGGTCC-3’(SEQ ID NO.4)；

探针P1：5’-TATCGATAGCGCCGAATGCCGG-3’(SEQ ID NO.5)，其中，所述探针P1的5’端结合荧光报告基团，所述探针P1的3’端结合荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为VIC，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

3.用于检测结核杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有外参质粒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述外参质粒为插入了SEQID NO.6的序列的pUC57质粒(pUC57-OUT)。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有内参质粒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述内参质粒为插入了SEQID NO.7的序列的pUC57质粒(pUC57-IN)。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含检测所述SEQ IDNO.7的序列的引物和探针，其序列如下：

第一轮PCR引物：

MF3：5’-TCGATTCTGTCCCACCGCCGT-3’(SEQ ID NO.8)；

MR3:5’-AGACTCGACGCGTAGTCCTCG-3’(SEQ ID NO.9)；

第二轮PCR引物和探针：

MF4：5’-AGATCGGATAGCCAGCACGGA-3’(SEQ ID NO.10)；

MR4：5’-TGCGCTGCGTCGACATATTCTA-3’(SEQ ID NO.11)；

探针P2：5’-FAM-ATGGGACGGCTAGCAATCCGTC-TAMRA-3’(SEQ IDNO.12)。

9.用于检测结核杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：采用权利要求1或2的引物和探针进行巢式荧光PCR扩增待检测样品，以判断样品中是否含有结核杆菌，其中，第一轮PCR反应体系如下：

第一轮PCR反应程序如下：

96℃变性3分钟后，25个循环(95℃变性20秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟)，72℃延伸10min；

第二轮PCR反应体系如下：

第二轮PCR反应程序如下：

50℃孵育2分钟，95℃变性10分钟后，40个循环(95℃变性15秒、60℃退火1分钟)。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：同时采取巢式荧光PCR扩增内参质粒和外参质粒，

其中，外参质粒为插入了SEQ ID NO.6的序列的pUC57质粒(pUC57-OUT)，内参质粒为插入了SEQ ID NO.7的序列的pUC57质粒(pUC57-IN)，；内参质粒和外参质粒的PCR反应体系和反应程序与权利要求9相同；

外参质粒的引物和探针与权利要求1的引物和探针相同，内参质粒的引物和探针的序列如下：

第一轮PCR引物：

MF3：5’-TCGATTCTGTCCCACCGCCGT-3’(SEQ ID NO.8)；

MR3:5’-AGACTCGACGCGTAGTCCTCG-3’(SEQ ID NO.9)；

第二轮PCR引物和探针：

MF4：5’-AGATCGGATAGCCAGCACGGA-3’(SEQ ID NO.10)；

MR4：5’-TGCGCTGCGTCGACATATTCTA-3’(SEQ ID NO.11)；

探针P2：5’-FAM-ATGGGACGGCTAGCAATCCGTC-TAMRA-3’(SEQ ID NO.12)。