[实用新型]一种检测杯状病毒的巢式PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属生物技术领域，涉及一种巢式PCR检测试剂盒，是一种检测杯状病毒的巢式PCR检测试剂盒，适用于杯状病毒的快速检测。

背景技术

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是猫的一种重要病原,在猫群中感染率很高,常单独感染或与其他病原混合感染引起猫的上呼吸道症状和口腔溃疡,也能引起猫的跛行、流产、慢性胃肠炎等其他疾病,严重威胁猫的健康。FCV呈世界性分布,不仅感染猫,也可以感染所有猫科动物,如虎、狮子、豹等,对这些野生动物的健康也造成了一定威胁。近年来在美国、英国和意大利等国家还相继暴发了由FCV引起的恶性系统性疾病(virulent systemicdisease,VSD),感染猫出现高热、食欲不振、萎靡、水肿、血凝异常等症状,有较高死亡率,且当前疫苗对VSD没有保护性。

目前的诊断检测识别FCV的方法包括:病毒学常规技术,病毒的分离与鉴定和电子显微镜检测；血清学方法,包括病毒的中和，琼扩,免疫荧光,酶联免疫法分子生物学检测,如传统的反转录-聚合酶链反应以及现在广泛应用的实时荧光定量PCR方法等。但是上述诊断方法均存在一定的缺陷。RT-PCR方法对病毒含量较低的样品的检测率较低。

根据病史、临床症状和流行特点进行诊断常常误诊,延误治疗并导致病毒的扩散和传播。而目前猫杯状病毒抗体的检测使用的是血清中和试验和间接免疫荧光等方法,检测耗时,重复性差、且多为实验室内部应用,缺少统一的标准。

实用新型内容

本实用新型的目的在于避免现有技术的不足提供一种检测猫杯状病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒。

为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案为：一种检测猫杯状病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括盒体1和内衬2，其中内衬2上设置有多个定位孔，所述试剂盒还包括PCR反应液管3、酶混合液管4、耐热Taq DNA聚合酶管5、外引物管6、内引物管7、阴性对照管8、阳性对照管9，其中PCR反应液管3包含PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；耐热Taq DNA聚合酶管5包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；

优选的，其特征在于所述PCR反应液管3、酶混合液管4、耐热Taq DNA聚合酶管5、外引物管6、内引物管7、阴性对照管8、阳性对照管9都为立方体结构；

优选的，内衬2上的定位孔都为正方形；

优选的，阴性对照管8为蓝色管体，阳性对照管9为红色管体：

优选的，外引物管6为黄色管体，内引物管7为橙色管体。

上述各种液体分别装在容器内，插入容器孔内。

所述的核苷酸序列为：

外引物管6中的引物为；

A：5‘-CTGATCTAARGAGCACYCTGT-3’

a；5‘-CACATGGKTGTCMTGGTANAC-3’；

内引物管7中的引物为

B：5‘-GCACTGGACCGATATAACTGACT-3’

B：5‘-ACAGTGGCCGAATCATAATC-3’

其中，所述的阳性对照质粒为：分离于辉瑞妙三多疫苗猫杯状病毒255株构建的质粒。

所述的阴性对照是蒸馏水。

PCR反应程序为：第一轮42℃45min；95℃3min；95℃30s,5,6℃30s，72℃，60s，35Cycle；72℃7min.4℃∞。第二轮95℃3min；95℃30s,58℃30s，72℃，30s 30Cycle；72℃7min，4℃∞。

判定结果：如果从待检测的样品中扩增到了309bp片段，则该检测样品含有猫杯状病毒。

本实用新型的有益效果是：本实用新型一种检测猫杯状病毒的巢式PCR的试剂盒，涉及一种检测危险性病原体的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原体的试剂盒，在6小时内就可以完成检测。

通过对猫杯状病毒的特异性检测，引物A，a，B，b优化的PCR条件对目标菌株扩增得到了目标PCR产物，可以特异的检测目标菌。但是对于8种非目标菌，均无扩增产物。

通过灵敏度的检测，对猫杯状病毒的直接PCR和Nest-PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为65pg/ul，而Nested-PCR的最低检出量是0.65pg/ul。