[发明专利]热稳定性β-葡萄糖醛酸糖苷酶制剂

说明书

本文提供了作为水性或冻干制剂，在高温和低温两者下均表现出长期稳定性的β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶制剂。本发明的制剂包含β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶如突变β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶、两性化合物、L‑组氨酸、β‑丙氨酸和糖。本文还提供了制备所述制剂的方法，以及使用所述制剂水解葡萄糖醛酸苷底物(包括阿片类和苯并二氮杂类)的方法。

背景技术

在哺乳动物中，葡萄糖醛酸苷化是使用UDP葡萄醛酸基转移酶系统使化合物去毒化或失活的主要手段之一。化合物通过葡萄糖醛酸基转移酶系统缀合以形成葡萄糖醛酸苷，其然后在尿液中分泌或者在胆汁中分泌到肠道下段。β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶催化多种β-葡萄糖醛酸苷的水解。考虑到葡萄糖醛酸苷化在化合物的去毒化中的关键作用，BGUS酶已被用于检测身体样本中的药物，例如检测犯罪嫌疑人身体样本中违禁药物的存在。例如，可以通过检测BGUS对葡萄糖醛酸苷形式的药物的水解来测试身体样品中可疑药物的存在。BGUS酶对葡萄糖醛酸的水解促进了通过诸如质谱法的方法对药物的分析，因为这种分析仪器在葡萄糖醛酸的存在下较不敏感。

BGUS酶的市售制备物通常作为水性制剂提供，并且可能在宽的温度范围或延长的时间段内不表现出酶稳定性。因此，需要适合于水性和冻干制剂两者的具有增强的热稳定性的BGUS酶制剂。

发明内容

本发明提供了BGUS酶制剂，其作为液体制剂或冻干制剂在低温(例如低于冰点)和高温(例如高于37℃)下均表现出热稳定性。因此，这些制剂允许冷冻/解冻，同时保持酶活性。此外，本文所述的制剂在升高的温度(＞37℃)下表现出延长的时间(例如大于10天)的酶活性，并且具有低聚集倾向，因此提供长的储存寿命。另外，制剂不含可能在某些类型的分析(例如质谱)中干扰酶的使用的赋形剂，例如洗涤剂和聚合物。因此，本发明的热稳定制剂可用于生物样品(例如尿样)的直接分析，具有最低限度的清除。

基于对氨基酸、糖和盐的大组的分析，已经发现含有两性化合物、氨基酸L-组氨酸和β-丙氨酸以及糖的制剂表现出上文讨论的期望的热稳定性和其他有利性质。因此，在一个方面，本发明涉及包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、两性化合物、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖的制剂。

在一个实施方式中，两性化合物选自甜菜碱一水合物、胆碱盐、甜菜碱盐、6-氨基己酸、5-氨基戊酸和4-氨基丁酸(GABA)。在一个实施方式中，两性化合物是甜菜碱一水合物。在一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以50mM-250mM的浓度存在。在又一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以250mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。

在一个实施方式中，糖选自蔗糖、山梨醇、木糖醇、甘油、2-羟丙基-β-环糊精和α-环糊精。在一个实施方式中，糖是蔗糖。在一个实施方式中，糖在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，糖在制剂中以50mM-500mM的浓度存在。在又一个实施方式中，糖在制剂中以500mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。

在一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以50mM-250mM的浓度存在。在又一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以250mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。

在一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以至少10mM的浓度存在。在另一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以10mM-50mM的浓度存在。在又一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以50mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。

在一个实施方式中，BGUS酶在制剂中是重组BGUS酶。在一个实施方式中，重组BGUS酶是突变BGUS酶。在一个实施方式中，突变BGUS酶是突变大肠杆菌BGUS酶，例如具有SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的酶。本文公开了用于制剂的另外的适合BGUS酶。