[发明专利]一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法

说明书

本发明提供了一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法。将密码子优化的FMDV的P12A和3C基因两个ORF串联插入转移载体构建重组表达质粒；或通过启动子SV40下的包含P12A3C基因的单一ORF克隆入载体构建重组表达质粒，转化感受态细胞得到重组Bacmid‑DNA，转染sf9细胞，得到能够表达口蹄疫病毒样颗粒蛋白的昆虫细胞。将该细胞培养后收集上清，超滤浓缩、离心、层析纯化VLP，制备口蹄疫病毒样颗粒疫苗。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法，以及以其制备的口蹄疫疫苗。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是一种急性、高度传染性的动物疾病。主要侵害偶蹄目动物，偶见于人和其它动物。易感动物主要包括牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼和猪等20个科的70多种偶蹄类家养和野生哺乳动物。由于口蹄疫的高度传染性和对农业经济的重大影响，国际兽疫局(OIE)将其列为A类动物传染病的首位。

2005年亚洲1型口蹄疫的传入，2009年A型口蹄疫的传入，特别是近年来O型中和逃避变异株的广泛流行，已对我国的养猪业和养牛业造成不可估量的损失。对于大多数国家而言，以免疫预防为主的策略是控制和消灭口蹄疫的唯一有效途径，而免疫预防的难题来自口蹄疫病毒的高度变异性和多型性、动物机体特别是猪体对口蹄疫病毒疫苗免疫的顿感性、以及发展中国家较低水平的口蹄疫疫苗制备工艺和产品质量。根据充分的调查和研究，我国现有的口蹄疫全病毒灭活疫苗不但免疫效力差，而且副反应重，流行的O型变异株可基本上可逃逸现有疫苗的保护作用，这导致国家免费发放的疫苗少被使用、口蹄疫周而复始地流行。每次流行的间歇期是自然感染免疫而不是疫苗接种的结果；由于不同血清型病毒和变异株的同时存在和流行，口蹄疫感染常重复发生，所以研发和生产新型O型口蹄疫疫苗迫在眉睫。

传统疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗两种类型。其中弱毒疫苗采用经典的弱化病毒的方式，将母毒通过在豚鼠，鸡胚或者细胞种经过多代的培养弱化，使病毒逐渐发生基因突变，产生弱毒毒株。弱毒毒株在组织培养物中经过大量扩增后，加入佐剂等制成疫苗。但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸疫苗加工厂等不安全因素，世界上一些地区口蹄疫的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关，促使人们寻求一种更加安全有效的口蹄疫疫苗。口蹄疫弱毒疫苗在进行免疫预防的过程中，能产生一定水平的保护，对口蹄疫的流行有一定的控制作用。但是由于弱毒疫苗也是活病毒，在预防接种的过程中造成动物携带病毒的状态，在易感动物体内长期存活的过程中，弱毒的口蹄疫毒株很有可能恢复毒力。同时，弱毒病毒在易感动物体内的增殖也会对产生的保护免疫有抑止的作用，不能达到最佳的免疫效果。由于上述的原因，弱毒疫苗已经逐渐淘汰，但灭活疫苗还在许多国家和地区广泛应用。

由于口蹄疫病毒的不断变异和新病毒的出现，传统灭活和裂解疫苗对人类和牲畜的保护率在下降，灭活不彻底导致的散毒时有发生，研发新型亚单位疫苗尤为迫切。病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗提供了一个新的契机。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒的一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白具有天然的自组装配能力，可形成与天然病毒颗粒相似的空间构型和抗原表位但无病毒核酸，免疫原性强，又没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了构象表位，可通过和全病毒感染机体一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生体液免疫和细胞免疫，缩短空窗期。VLP疫苗的优点还在于避免了灭活过程中可能破坏一些重要的抗原决定簇。此外，还有一个优点是可根据其需要任意改造抗原的氨基酸序列，使之能更好地刺激机体产生保护性免疫反应。