[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子的复性及纯化方法

说明书

一种重组人粒细胞刺激因子的复性及纯化方法，通过在复性前以缓冲液置换方式去除还原剂，提高了复性工艺的可控性和复性率，优化了复性缓冲液的组成。上述方法适合大规模工业化放大生产，对设备要求低，操作简单，得到的蛋白纯度高，稳定性好，可降低最终产品在临床中的副作用，提高药品的安全性和有效性。

技术领域

本发明涉及的是生物医药及生物工程下游蛋白纯化领域，具体的涉及一种重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的复性及纯化方法，本发明复性率高，操作简单，适合于工业化放大生产。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)属于造血生长因子家族。hG-CSF是由单核巨噬细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞合成的蛋白，由174个氨基酸组成，分子量为19KD，其序列是公知的，如序列1所示。hG-CSF的主要作用机理有：(1)特异地作用于骨髓粒细胞和巨噬细胞的前驱细胞，促进其向成熟粒细胞分化、增殖；(2)作用于骨髓成熟中性粒细胞，促进其从骨髓向外周血释放；(3)激活成熟粒细胞的功能，增强其游走、吞噬及杀菌能力，延长其存活时间；(4)刺激骨髓造血干细胞向外周血释放。

hG-CSF在临床上有非常广泛的用途，治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，目前主要用于防治化疗及放疗后引起的骨髓抑制；此外还用于自身骨髓移植、某些类型的白血病、艾滋病的白细胞减少和再生障碍性贫血等，均显示具有显著的疗效。

hG-CSF的天然来源有限，产量甚微，不能满足临床应用的需要。同时聚乙二醇修饰的hG-CSF实现了长效增加外周血中性粒细胞数的目的，其规模化生产同样需要大量的hG-CSF原液，因此hG-CSF原液的大规模生产有重大的经济意义和社会意义。

大肠杆菌是目前最为广泛用来表达外源蛋白的表达系统，然而rhG-CSF在大肠杆菌系统中基本以包涵体形式表达，表达产物没有生物活性，欲利用其生物活性，必须先经变性剂充分溶解，然后经复性过程恢复其天然构象，才能得到高活性的蛋白样品，尔后通过纯化步骤得到高纯度，有功能的产品。利用rhG-CSF不依赖于糖基化修饰即可发挥天然分子相应的生物学活性的特点，选择在大肠杆菌中表达该蛋白是最为简便可行而且产率较高的方法。

工艺研发过程中，影响得率的主要步骤在于复性，复性效果好，得率必然高。复性完全是自发和随机的，因此复性速度慢，回收率低。目前国内外所用的蛋白质复性方法均是依据排除使蛋白变性的环境，具体方法有透析法、超滤复性、柱上复性、稀释法等。

透析法需要时间长，且需要多次更换透析溶液，同时透析袋内部溶液在透析过程中是不均一的，靠近透析膜的溶液变性剂浓度下降快而内部下降慢，只有部分蛋白处于适于复性的环境，其他蛋白很容易聚集、絮凝、沉淀，使复性回收率下降，更主要的是受透析袋规格的限制，透析法难以放大至生产规模。

Amgen公司的美国专利5,849,883在1998年公开了一种G-CSF纯化方法，其中rhG-CSF的复性采用了在搅拌条件下加入硫酸铜，通过金属离子氧化的的方式进行蛋白复性。该方法缺点是有痕量金属离子残留的风险，进而影响药品相关检测及药品安全性，目前在工业化生产中已很少采用。

中国专利CN1167150A报道了使用中空纤维超滤的方式进行rhG-CSF的复性，虽然可以用于大规模生产，但存在以下缺点：①受浓差极化现象影响，复性蛋白溶液在中空纤维柱内浓度并不均一，容易出现蛋白絮集、沉淀甚至堵塞中空纤维柱的情况；②大规模生产中往往需要长度超过90cm的中空纤维柱提供足够的膜面积，研发阶段的中空纤维柱长度都是在30-60cm范围内，因此中空纤维超滤的操作无法线性放大，对于复杂的复性过程难以进行细致的工艺研究来保障工艺的稳定性。