[发明专利]氧化还原酶的活性测定方法

说明书

本发明涉及一种HAO的活性测定方法，其包括：在四唑盐的存在下使HAO与羟胺接触。此外，本发明还提供一种微生物的培养方法，其包括：在液体培养基储存容器内分隔设置的含有微生物的试样储存容器内培养微生物，含有微生物的试样储存容器具有细孔。

技术领域

本发明涉及一种HAO的活性测定方法，其包括：在四唑盐的存在下使羟胺氧化还原酶(HAO)与羟胺接触。本发明还涉及HAO的制造方法。本发明还涉及一种HAO抑制剂(inhibitor)的筛选方法，其包括：在四唑盐的存在下使HAO与羟胺及候选化合物接触。本发明提供一种微生物的培养方法，其包括：在液体培养基储存容器内分隔设置的含有微生物的试样储存容器内培养微生物，含有微生物的试样储存容器具有细孔。

背景技术

将作为化肥特别重要的氮肥，以氨态氮(NH₄⁺)过量投入于农田。然而，其大部分被硝化，从而导致氮肥从农田流出以及温室气体(N₂O)的产生。现有的硝化抑制剂存在诸如因挥发性而不能在20℃以上使用、效果差以及具有致癌性和残余毒性的问题，因此期待消除这些问题的新的硝化抑制剂。现有的硝化抑制剂将氨单加氧酶(AMO)作为目标来考虑。另一方面，至今未知有将所谓硝化反应核心酶的羟胺氧化还原酶(Hydroxylamineoxidoreductase，HAO)作为目标的硝化抑制剂。此外，虽然已知各种HAO的活性测定方法，但是在灵敏度和成本方面都不是满意的方法。而且，能够适用于高通量筛选的HAO活性的测定方法至今未被开发。

微生物的培养时时伴随着困难，存在如下问题：培养时的菌体浓度最大也处在OD₆₀₀＝0.1(低于每10L 1g)程度，因此不仅需要大量的培养基，而且在收集细菌上花费很多的劳力。这对于来自土壤、堆肥或者活性污泥的微生物的情况是特别深刻的问题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1

H.Maeda,S.Matsu-ura,Y.Yamauchi,H.Ohmori,Resazurin as an electronacceptor in glucose oxidase-catalyzed oxidation of glucose.,Chem.Pharm.Bull.49(2001)622–625.

非专利文献2

W.J.Maalcke,A.Dietl,S.J.Marritt,J.N.Butt,M.S.M.Jetten,J.T.Keltjens,T.R.M.Barends,B.Kartal,Structural basis ofbiological NO generation byoctaheme oxidoreductases.,J.Biol.Chem.289(2014)1228–42.

非专利文献3

J.Schalk,S.de Vries,J.G.Kuenen,M.S.Jetten,Involvement of a novelhydroxylamine oxidoreductase in anaerobic ammonium oxidation.,Biochemistry.39(2000)5405–12.

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种羟胺氧化还原酶的活性测定方法。该方法在灵敏度和成本方面实用，并且测定简单。此外，本发明的目的在于提供一种微生物的培养方法，该方法能够使培养微生物时的培养基的制备及收集细菌所需的劳力高效，同时可获得能够充分满足的菌体浓度。而且，本发明的目的在于提供一种新的方案，该方案能够从含有大量酶的试样中简单、快速且高灵敏地分析HAO的活性。

用于解决技术问题的方案